Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký

Aug 06, 2011#12011-08-06T03:51

II. phương pháp sản xuất [+] SpoilerEnzyme có thể được phân tách từ nhiều nguồn như là động vật, thực vật và vi sinh vật. Mỗi nguồn enzyme cho một số tính chất đặc trưng, cung cấp những enzyme đặc hiệu cho quá trình chế biến. Do đó, mặc dù vi sinh vật đóng vai trò là nguồn cung cấp enzyme chính cho quá trình chế biến bởi giá thành và đa dạng về chủng loại enzyme nhưng các enzyme từ thực vật và động vật cũng góp phần làm cho ngành chiết tách enzyme trở nên đa dạng và thêm hấp dẫn. Ví dụ: Từ động vật chúng ta có một số enzyme, trong đó có rennin là enzyme từ ngăn thứ 4 của dạ dày bê non giúp quá trình đông tụ casein trong sản xuất phomai. Từ thực vật, ta cũng có một số loại enzyme được ứng dụng trong quá trình chế biến như là bromelin từ dứa, papain từ đu đủ và ficin từ sung. Các enzyme thuỷ phân tinh bột [invertase, amylase,Glucoseamylase] Các enzyme thủy phân pectin [Pectin-esterase, Polygalacturonase, Pectate lyase] Các enzyme thuỷ phân protein[bromelin, papain, ficin,…]

Enzyme oxi hoá thì chúng ta có những đại diện tiêu biểu là Poluphenoloxidase, Catalase, peroxidase, Glucoseoxidase,lypoxygenase,…].

II.1. Các phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme
II.1.1.Các phương pháp phá vỡ tế bào
II.1.1.1.Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học [+] Spoiler Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bào động vật, thực vật và VSV. Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ cơ quan [hay mô bào] của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc các thành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ. Đối với tế bào và mô bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhận enzyme ngay. Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định. Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả. Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môi trường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng. Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tế bào [trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào]. Tuy nhiên, trong thời gian gần đây, việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ học được ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều.

Phương pháp đồng hóa áp lực cao:

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô công nghiệp. Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống [máy đồng hóa maton-gaulin]. Tế bào bị phá vỡ bởi lực cắt và sức nén. Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lực cần có khác nhau. Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khác nhau. Ví dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar. Phương pháp đồng hóa áp lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tế bào động vật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này.

Phương pháp nghiền ẩm:

Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme. Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn. II.1.1.2.Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học [+] SpoilerNgoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải là phương pháp cơ học. Các phương pháp bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme [ở một số tài liệu người ta còn gọi là phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học].
Phương pháp hóa học: Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng oxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện. Tuy nhiên vì trong quá trình thực hiện, người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone.

Phương pháp vật lý:

Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp. Một phương pháp vật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở dạng thử nghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp này là: khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phù xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 400C [thao tác nâng nhiệt rất nhanh], khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.

Phương pháp sinh học [phương pháp enzyme]:

Có hai phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào. Phương pháp tự phân là phương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một số thành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và là của tế bào đó. Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào. Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ. Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị phá hủy. Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.

Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụng enzyme từ ngoài tế bào. Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hành các quá trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào. Người ta thường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bào thực vật. Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễ dàng trong mọi điều kiện [phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất công nghiệp]. Ngoài ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác.

II.1.2. Các phương pháp tách enzyme
II.1.2.1. Các phương pháp cơ học [+] SpoilerCác phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp: - Phương pháp ly tâm - Phương pháp lọc

 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhận enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào. Phần lớn các enzyme ngoại bào [exoenzyme] là những enzyme hòa tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau: - Protein có hoạt tính sinh học - Các chất hòa tan khác - Nước Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác. Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp. Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa. Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn [%], kích thước vật lắng.

 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan. Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, độ nhớt dịch lọc, sức đề kháng. Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau: - Lọc ép: Lọc ép [lọc đĩa, buồng lọc] thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả. - Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả. - Lọc theo dòng chảy cắt ngang: Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn.

- Lọc thông thường: Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.

II.1.2.2. Phương pháp cô đặc [+] SpoilerDung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau: - Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme - Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này - Tăng khả năng bảo quản enzyme - Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản - Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những phương pháp sau:

 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào [trừ enzyme nhân tạo]. Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ chết. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại. Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo nguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá trình cô đặc. Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao. Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết. Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau: - Bốc hơi lớp mỏng - Bốc hơi ly tâm lớp mỏng - Bốc hơi ống dài

 Phương pháp kết tủa

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương. - Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa. - Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch. • Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay ammonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%. • Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên. Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng lớn nước. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ. Từ đó làm gia tăng độ hòa tan của chúng. Các enzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ. Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực VanderWaals [giống như ở muối]. Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng cho quá trình tủa là ít nhất. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme. • Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường [nhiệt độ phòng thí nghiệm] và lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều [khoảng 5 – 15 %]. Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho kỹ thuật làm sạch sau này. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau. Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme. • Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid.

Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.

II.1.2.3. Phương pháp siêu lọc [+] SpoilerPhương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc, thẩm thấu ngược. Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly propylene làm nguyên liệu màng lọc.

Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.

II.1.3. Phương pháp tinh sạch enzyme
II.1.3.1. Phương pháp kết tinh [+] SpoilerTrong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến II.1.3.2. Phương pháp điện di [+] SpoilerPhương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi. II.1.3.3. Phương pháp sắc ký [+] Spoiler Phương pháp sắc ký lọc gel Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.

 Sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử protein. Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp. Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH. Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.

 Sắc ký kỵ nước

Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trình phân đoạn với muối. Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đã được làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate.

 Sắc ký đồng hóa trị.

Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái tĩnh.

 Sắc ký ái lực

Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền không hòa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.

Aug 06, 2011#22011-08-06T04:00

II.1.2.Các phương pháp tách enzyme
II.1.2.1.Các phương pháp cơ học Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm hai phương pháp: -Phương pháp ly tâm -Phương pháp lọc

 Phương pháp ly tâm

Ly tâm là quá trình tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật, muốn thu nhân enzyme nội bào ta phải tiến hành một giai đoạn phá vỡ tế bào. Phần lớn các enzyme ngoại bào [exoenzyme] là những enzyme hòa tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzyme thô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau: -Protein có hoạt tính sinh học -Các chất hòa tan khác -Nước Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác. Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiều thành phần. Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ở VSV. Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp. Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính của enzyme. Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu ly tâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa. Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sử dụng một số kiểu ly tâm khác. Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xét đến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn [%], kích thước vật lắng.

 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa tan. Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc; độ nhớt dịch lọc; sức đề kháng. Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau: -Lọc ép: Lọc ép [lọc đĩa, buồng lọc] thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả. -Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó, lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả. -Lọc theo dòng chảy cắt ngang. Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu chất rắn. -Lọc thông thường. Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ở một số nhà máy vẫn còn sử dụng. Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằng những phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn.

II.1.2.2.Phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý một khối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau: -Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme -Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này -Tăng khả năng bảo quản enzyme -Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản -Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trong những phương pháp sau:

 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào [trừ enzyme nhân tạo]. Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tế bào sống. Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào sẽ chết. Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vì khi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chất của tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại. Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơn nhiệt độ sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme. Tùy theo nguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gia nhiệt trong quá trình cô đặc. Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao. Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫn đến triệt tiêu hoạt tính. Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiết trong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết. Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau: -Bốc hơi lớp mỏng -Bốc hơi ly tâm lớp mỏng -Bốc hơi ống dài

 Phương pháp kết tủa

Kết tủa là phương pháp được sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu enzyme trong phòng thí nghiệm và sản xuất enzyme trong quy mô sản xuất công nghiệp. Phương pháp kết tủa dựa trên nguyên tắc, enzyme là một phức hợp protein có khả năng tạo kết tủa với một số dung môi. Trong quá trình kết tủa, người ta phân biệt hai thuật ngữ: kết tủa âm và kết tủa dương. -Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp. Phần protein cần thiết nằm trong dung dịch chứ không nằm trong phần tủa. -Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phần kết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch. •Phương pháp kết tủa bằng muối: Muối nồng độ cao có tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp enzyme người ta thường sử dụng muối ammonium sulfate. Các thiết bị dùng trong quá trình kết tủa bằng muối ammonium sulfate thường được chế tạo bằng thép không rỉ. Tuy nhiên, thép không rỉ có nhiều loại, do đó nhiều trường hợp thiết bị chế tạo từ thép không rỉ cũng bị ăn mòn bởi ammonium sulfate. Sau này người ta thay ammonium sulfate bằng sodium sulfate, muối này tuy không gây hư hỏng thiết bị, song chúng lại không có tính hòa tan tốt. Nhiệt độ tiến hành kết tủa có thể ở 35 – 400C, nhưng để tránh khả năng làm mất hoạt tính enzyme, người ta thường phải làm lạnh dung dịch muối và dung dịch enzyme trước khi trộn hai loại dung dịch này với nhau. Khoảng tối ưu của nồng độ muối dùng trong kết tủa enzyme rất rộng, khoảng 20 – 80%. •Phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của enzyme, ảnh hưởng solvate hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác giữa các phân tử enzyme sẽ bị tăng lên. Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng lớn nước. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ. Từ đó làm gia tăng độ hòa tan của chúng. Các enzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ. Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực Van der Waals [giống như ở muối]. Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng cho quá trình tủa là ít nhất. Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Khi tiến hành kết tủa enzyme bằng những dung môi hữu cơ cần hết sức lưu ý đến nhiệt độ. Do enzyme rất nhạy cảm với nhiệt độ khi có mặt của các chất như ethanol hoặc acetone, nên bắt buộc ta khi tiến hành kết tủa enzyme phải làm lạnh cả dung môi hữu cơ và dung dịch enzyme. Mức độ nhạy cảm nhiệt độ của enzyme khi có mặt các dung môi hữu cơ thường mạnh hơn mức độ nhạy cảm của enzyme với nhiệt độ khi có mặt của muối vô cơ. Người ta thường kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ từ 3 – 100C. Tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ enzyme có trong dung dịch enzyme. Nguyên tắc: khi cho dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm khả năng hòa tan của nước bao quanh enzyme. Hiện tượng này xảy ra là do sự giảm hằng số điện ly của dung môi, đẩy một lượng lớn nước. Các phân tử nước sắp xếp rất trật tự xung quanh các đoạn kỵ nước trên bề mặt enzyme có thể được thay thế bằng phân tử của dung môi hữu cơ. Từ đó làm gia tăng độ hòa tan của chúng. Các enzyme có tính kỵ nước mạnh sẽ có khả năng hòa tan hoàn toàn trong dung môi hữu cơ. Nguyên nhân cơ bản của sự quần hợp protein enzyme có thể do các lực tĩnh điện, lực Van der Waals [giống như ở muối]. Tương tác kỵ nước trong trường hợp này không có ý nghĩa lớn, tại điểm đẳng điện thì sự kết tủa diễn ra tốt nhất, khi đó lượng dung môi sử dụng cho quá trình tủa là ít nhất. •Kết tủa enzyme bằng polymer: Polyethylene glycol là một polymer cao phân tử được ứng dụng rộng rãi trong kết tủa protein, enzyme. Nhiều tác giả cho rằng cơ chế lắng của chúng gần giống dung môi hữu cơ. Phương pháp này có ưu điểm là ta có thể thực hiện quá trình kết tủa enzyme ở nhiệt độ bình thường [nhiệt độ phòng thí nghiệm] và lượng polyethylene glycol cần sử dụng để kết tủa không nhiều [khoảng 5 – 15 %]. Nếu sử dụng nồng độ cao sẽ làm độ nhớt của dung dịch rất cao và như thế sẽ tạo ra nhiều khó khăn cho kỹ thuật làm sạch sau này. Polymer được sử dụng rất rộng rãi để kết tủa enzyme cả trong nghiên cứu và trong sản xuất theo quy mô công nghiệp. Các polymer được sử dụng nhiều là polyethylenamin và polyethylene glycol với những khối lượng phân tử khác nhau. Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng nồng độ polymer khoảng 15 – 20% để kết tủa enzyme. •Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện của protein-enzyme: Protein là chất lưỡng cực, chúng có cả nhóm acid và nhóm base. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc vào pH, mức độ này là tối thiểu khi chúng ở điểm đẳng điện, phần lớn protein có điểm đẳng điện ở khoảng acid, vì thế quá trình này gọi là kết tủa acid. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường được thực hiện ở quy mô nhỏ, chứ không thực hiện ở quy mô công nghiệp. Thời gian tạo điểm đẳng điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme. Như vậy thiết bị phản ứng càng lớn. Khi đó, thời gian khuấy trộn và thời gian lắng kết tủa càng dài, enzyme càng dễ bị biến tính.

II.1.2.3.Phương pháp siêu lọc

Phương pháp siêu lọc là phương pháp sử dụng những màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. Phương pháp này được ứng dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Phương pháp tách vật chất bằng màng siêu lọc hiện nay có ba loại là: lọc dòng chảy cắt ngang, siêu lọc, thẩm thấu ngược. Trong những phương pháp trên, phương pháp lọc dòng chảy cắt ngang để thu nhận sinh khối vi khuẩn, tách vi khuẩn khỏi dung dịch enzyme. Phương pháp thẩm thấu ngược dùng để thu nhận các chất có khối lượng phân tử thấp và có khả năng hòa tan. Trong khi đó, siêu lọc lại được sử dụng rất rộng rãi để thu nhận enzyme, siêu lọc có thể giúp ta thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng1.000 – 300.000 dalton. Người ta sử dụng cellulose acetate và các loại polymer hữu cơ như poly sulfone, poly-vinylidene và poly propylene làm nguyên liệu màng lọc. Trừ cellulose acetate ra, các loại nguyên liệu màng lọc khác kể trên có thể rửa bằng kiềm, acid hoặc bằng hơi nóng. Ngoài ra, người ta còn tách muối trong dung dịch enzyme bằng lọc thẩm tích.

Aug 06, 2011#32011-08-06T04:14

II.1.3. Phương pháp tinh sạch enzyme
II.1.3.1. Phương pháp kết tinh Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

II.1.3.2. Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. Người ta cũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi.

II.1.3.3. Phương pháp sắc ký

 Phương pháp sắc ký lọc gel Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme. Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng.

 Sắc ký trao đổi ion

 Sắc ký kỵ nước

 Sắc ký đồng hóa trị.

Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái tĩnh.

 Sắc ký ái lực

Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền không hòa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký.

Aug 06, 2011#42011-08-06T04:31

II.2.1. Thu nhận enzyme từ thực vật
II.2.1.1. Thu nhận enzyme amylase Hiện nay ta biết có 6 loại amylase, trong đó α-amylase, β-amylase, γ-amylase [hay glucose] thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside của tinh bột, glycogen và các polysaccharide đồng loại. Các amylase còn lại: dextrin-6-glucanhydrolase [hay dextrinase] thủy phân các liên kết α-1,6-glucoside. Sáu loại amylase này được xếp thành hai nhóm: endoamylase [enzyme nội bào], và exoamylase [enzyme ngoại bào]. Enzyme amylase được thu nhận chủ yếu từ các hạt nảy mầm như: malt đại mạch, malt thóc và ngô. Có hai phương pháp là tinh sạch enzyme amylase là phương pháp sắc ký và thu nhận bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide.

 Thu nhận enzyme amylase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide [PAGE]

Hạt lúa được ngâm nước và ủ cho nảy mầm. Sau 14 ngày, cây mầm được xay nhuyễn với đệm Tris-HCl 0,05M [pH 8,0]. Tỷ lệ mô đệm là 1:2 [trọng lượng/thể tích]. Hỗn hợp sau khi đồng hóa được ly tâm với tốc độ 10.000 rpm trong 15 phút ở nhiệt độ 40C. Phần nổi ở trên được chuyển sang một ống ly tâm khác và được xem là dịch enzyme. Gel được chuẩn bị sẵn sàng và được đưa vào điện di với cường độ dòng điện 70V. Sau khi hoàn tất việc chạy điện di, gel được đưa ra nhuộm với dung dịch nhuộm màu để xác định sự hiện diện của amylase.

 Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký

Hạt lúa được cho hút ẩm và ủ trong tối ở 300C trong 8 ngày. Hạt nảy mầm được đồng hóa trong một máy trộn và một polytron với 800ml dung dịch đệm TRIS/HCl 50mM [pH 8,5] [dung dịch đệm A]. Sản phẩm đồng hóa được ép qua hai lớp lưới nylon và dịch lọc thô được đưa vào ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Phần ở trên được xem như dịch enzyme thô. Dịch enzyme thô được cho kết tủa với [NH4]2SO4 [25 – 60%]. Phần kết tủa thu được đem hòa tan trong 10ml dung dịch đệm A và ly tâm với tốc độ 15.000 vòng trong 20 phút. Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích thì phần nổi ở trên trong dung dịch đệm A thì sẽ được cho qua cột DEAE cellulose, DE 52 và được cân bằng với dung dịch đệm A; enzyme được tách rửa bằng NaCl nồng độ 0 – 0,5M. Dung dịch được thẩm tích và được lôi cuốn qua cột CHA [ancyclodextrin], cột này đặc biệt được sử dụng để lôi cuốn amylase. Các phân đoạn qua cột thu được sẽ được chuyển qua 12 sắc ký cột superpose. Những phân đoạn này được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

II.2.1.2. Thu nhận enzyme bromelin

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khả năng phân giải protein, được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt ở cây dứa [thân và trái]. Enzym bromelin có thể thu nhận từ thân, thịt quả, hay chồi quả. Để thu nhận Enzym đầu tiên người ta phải phá vở cấu trúc mô [ thân hoặc quả] chứa enzym bằng cách nghiền mô để thu được dịch chiết có chứa enzym bằng quá trình nghiền, ép, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin. • Quá trình nghiền xé: Mục đích là tăng hiệu suất ép [ qua máy nghiền,hiệu suất ép dứa tăng 30% ] • Quá trình ép : Dứa sau khi nghiền có kích thước khoảng 1-2 cm được chuyển sang thiết bị ép. Trong công nghiệp hiện nay thường dùng loại máy ép trục vít , hiệu suất 50– 70%. • Quá trình lọc: Có thể lọc qua vải lọc để loại các tạp chất thô ra khỏi. • Quá trình ly tâm: Quả dứa thân xay nhuyễn, lọc bỏ bã và thu được dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000vòng/ phút trong 10 phút để loại bỏ chất sơ để thu được chiết có chứa Bromelin.

 Các phương pháp tách Bromelin

Chủ yếu hiện nay sử dụng phương pháp thẩm tích và phương pháp kết tủa.

 Phương pháp kết tủa

• Nguyên tắc: Điểm đẳng điện của đa số Protein là pH < 7 nên đa số các Protein mang điện tích âm.Trong dung dịch các đầu mang điện tích âm này kết hợp với các đầu mang điện tích dương của nước. Sự kết hợp này đã tạo nên lớp áo bao xung quanh phân tử protein, điều này ngăn cản sự kết tủa của các enzym. Vì vậy để phá vở lớp nước xung quanh phân tử Protein người ta bổ sung các dung môi, hóa chất có ái lực với nước mạnh hơn so với Protein, để lôi kéo nước ra khỏi Protein để cho Protein tủa xuống Các dung môi thường sử dụng để kết tủa Protein là acetone hoặc ethanol hay các muối trung tính có nồng độ cao [Amoni sunfat]. • Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng enzyme: Độ tinh khiết của các dung môi, nồng độ muối sử dụng. pH của dịch chiết. Nhiệt độ kết tủa. Thời gian tiếp xúc của tác nhân và dịch chiết. • Tiến hành: Sử dụng [NH4]2SO4: Cho từ từ và khuấy đều [NH4]2SO4 vào dịch nước ép theo tỷ lệ [523g[NH4]2SO4 / 1 lit dịch nước ép]. Để yên ở nhiệt độ phòng trong 10-15 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 6000vòng/phút trong 5 phút để thu nhận kết tủa. Sử dụng Ethanol: làm lạnh dịch nước dứa sau ly tâm[khoảng 4oC ], cho ethanol 960 [làm lạnh khoảng 10oC] theo tỷ lệ 4:1[ 4 dịch nước ép, 1 ethanol] ở nhiệt độ 00c, Để yên trong 3-4 giờ. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000vòng/phút. Trong 5 phút, rữa tủa bằng acetone và thu nhận kết tủa. Sử dụng Acetone : Thêm một thể tích Acetone lạnh[10oC] vào một thể tích dịch nước dứa sau ly tâm. Để yên trong vòng 1giờ ở nhiệt độ 0 - 4oC. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000v/p, loại bỏ kết tủa.Thêm 2 lần thể tích aceton lạnh vào để 0 – 4oC trong vòng 1 giờ, ly tâm thu được kết tủa.  Phương pháp hấp phụ: Có thể sử dụng nhiều chất làm chất hấp phụ enzym, thông thường trong sản xuất Bromelin người ta sử dụng kaolin [Kaolin là một loại khoáng sản có kích thước hạt nhỏ khoảng 1µm, độ phân tán cao và có tính hấp phụ tốt]. Trình tự thực hiện như sau : Cho Kaolin khô hoặc đã ngâm cho trương nở vào dịch nước dứa theo tỷ lệ 25mg Kaolin/1 ml dung dịch nước dứa. Khuấy đều sau đó ly tâm để thu tủa, tủa thu được gọi là Bromelin-Kaolin.

 Phương pháp siêu lọc:

Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách các thành phần trong chất lỏng đó. Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua. Tùy theo kích thước của lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ còn những các phân tử lớn sẽ bị giữ trên màng. Cách thực hiện: Sử dụng màng FS 50PP có giá trị loại trừ 30.000, diện tích màng 336cm2. Dịch nước sau khi ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc. Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc. Tách chiết protein từ dịch chứa bằng CMC: CMC vải màng được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0,005M, pH 6,1, sau đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC. Rửa protein bằng đệm phosphate 0,05M, pH5,6. Sau đó, tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05M, pH 7,1 và NaCl 0,5M khuấy trộn 3-4 lần. Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin. Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất. Sau đó, góp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzyme.

 Phương pháp tinh sạch enzym bromelin

Phương pháp thẩm tích, lọc qua sepadex, phương pháp sắc ký.

 Phương pháp thẩm tích :

Pha enzym thô với dung dịch đệm Na3PO4 0.03M có pH=7.2. Sau khi tất cả các enzym hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào môi trường có chứa Na3PO4 0.03M[1g enzym thô hòa10ml dung dịch đệm và 1 lít dung dịch môi trường ]..Tiến hành thẩm tích trong 6h cứ sau 2 giờ thay dung dịch đệm bên ngoài 1 lần . Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ của quá trình thẩm tích tăng, nhưng khi sử dụng nhiệt độ vượt quá giới hạn sẽ gây biến tính các enzyme. Để giảm sự biến tính của enzym do nhiệt người ta thường tiến hành thẩm tích enzym ở nhiệt độ thấp.

 Phương pháp tinh sạch bằng cách lọc qua Sephadex:

Sephađex là dẫn xuất của polysaccharide dextran trong đó các phân tử của chúng liên kết nhau bởi các liên kết ngang tạo thành “rây phân tử “, có dạng hạt. Các chất có phân tử lượng nhỏ sẽ khuếch tán vào các hạt Sephadex, và bị giữ lại bên trong với một thời gian nhất định. Các chất có phân tử lượng lớn thì không khuếch tán vào bên trong hạt nên thời gian di chuyển nhanh hơn. Sephadex G-50 được đun sôi cách thủy 100oC trong vòng 1 giờ sau đó nhồi vào cột kích thước cột [23.5*0.9cm].Khi nhồi cột phải chú ý sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt khí. • Tiến hành: Hòa tan enzym thô theo tỷ lệ 100mg enzym thô/1ml dịch đệm Na3PO4 0.03M. Cho dung môi phân ly chảy qua cột với vận tốc 2ml/7phút. Căn cứ vào thời gian lưu của Bromelin để có thể thu nhận enzyme theo từng phân đoạn. Quá trình này thường diễn ra ở nhiệt độ thấp.

 Phương pháp tinh sạch bằng phương pháp sắc ký:

Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Duolit CS101 ở pH 6.05 sẽ cho 2 phân đoạn khác nhau về diện tích peak và hoạt tính xúc tác. Bromelin thân cho chạy sắc ký trên Bio Rex ở pH 6.1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần acid amin. Bromelin thân khi chạy sắc ký trên sephadex G-75 ở pH bằng 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzym khác nhau.

 Hoạt tính của Enzym Bromelin:

 Hoạt tính phân giải của enzym bromelin: Bromelin có 3 hoạt tính phân giải khác nhau: peptidase, amidase,và esterase. Bromelin có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên và cơ chất tổng hợp

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Bromelin

 Ảnh hưởng bởi cơ chất : Trên các loại cơ chất khác nhau thì Bromelin có hoạt tính khác nhau: Nếu cơ chất là Hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelin mạnh hơn papain gấp 4 lần. Nếu cơ chất là Casein thì hoạt tính của Bromelin tương tự như Papain. Còn đối với cơ chất tổng hợp như BAA thì khả năng thủy giải của Bromelin yếu hơn Papain.

 Ảnh hưởng bởi nhiệt độ :

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzym có liên quan chặt chẽ đến các yếu tố khác như: Độ tinh khiết, thời gian tác dụng, Ph, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym…. Ở dịch chiết quả [pH= 3.5] khi tăng nhiệt độ lên 60oC thì Bromelin vẫn còn hoạt tính. Nhưng đối với enzym tinh khiết thì bị vô hoạt ở 50oC, pH 4-10 thì enzym vẫn giữ hoạt tính tối đa trên Casein.

 Ảnh Hưởng của pH:

pH là yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến hoạt tính của enzyme. pH tối thích của enzym không ổn định mà phụ thuộc vào các yếu tố khác như nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme.

 Ảnh hưởng của các ion kim loại :

Các ion kim loại gắn vào tâm hoạt động của enzyme, muối thủy ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzym Bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ muối. Ngoài ra còn có những chất tác dụng với nhóm SH của trung tâm hoạt động của Enzym gây ức chế hoạt động của Enzym.

II.2.1.3. Thu nhận enzyme papain

Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S. Papain là một protease thiol, là một chuỗi popeptit gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. Papain được tách ra từ trái đu đủ xanh, papain thuộc nhóm enzym thủy phân được tách từ nhựa đu đủ. Nhựa cây đu đủ nằm trong ống dẫn nhựa trải khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ. Quả xanh 10 tuần tuổi là có nhựa nhiều nhất. Cây đang sinh trưởng tốt, thân cây mập mạp cho nhựa nhiều. Quả: lấy những quả đang còn xanh, vỏ quả căng mọng, có trọng lượng từ 0.3-1 kg là tốt nhất. Quả non quá hoặc quả già đều cho ít nhựa. Nên lấy nhựa ở độ đang 10 tuần tuổi. Thời gian lấy nhựa thường lấy vào sáng sớm, độ ẩm không khí cao Một số phương pháp thu nhận Papain bán tinh khiết: Nhựa đu đủ sau khi lấy về được chiết rửa 2-3 lần bằng cồn 90o, lọc lấy cặn và sau đó làm bay hơi cồn. Cặn được hòa tan trong nước cất sau đó cho tủa lại trong cồn, sấy ở 37-40o C sau đó thu được Papain. Ngâm papain trong thể tích nước nhất định trong vài giờ, có thể bổ sung thêm Glycerin tạo thành dịch nhũ tan đều, lọc qua lớp vải màn. Dùng Aceton lạnh theo tỷ lệ 2:1 so với dịch lọc. Sau đó ly tâm lạnh để thu được kết tủa. Sấy Ở 45oC[ thông thường sấy chân không], sau đó nghiền thành bột. Tinh chế enzym có thể dùng phương pháp kết tủa phân đoạn sử dụng [NH4]2SO4 và NaCl.

 Phương pháp thu nhận Papain tinh khiết :

Nhựa đu đủ ngoài Papain, chymopapain còn chứa một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… còn có các tạp chất khác, nên phải dùng các phương pháp hòa tan nhựa đu đủ để loại các tạp chất. Nhựa đu đủ khô được nghiền kỹ với celite và cát mịn sạch theo tỉ lệ 18:10:15 thì được trộn với dung dịch Cysteine 0.04M [hòa tan 6.3g Cysteine hydrocloride, 1000 NaOH[0.054M], pH khoảng 5.7]. Dung dịch sau đó được để lắng trong điều kiện thường và gạn những bọt nổi trên mặt. Sau đó, dung dịch chứa enzyme được cho qua thiết bị lọc [có thể tiến hành trong điều kiện chân không nhẹ] và thu lấy dịch lọc. Lúc này, dịch chứa enzyme thu được là một dung dịch có màu trắng sữa. Theo ý nghĩa vật lí, dịch lọc lúc này đã được loại bỏ hết những cặn thô, rắn và những thành phần không tan trong nước. Các quá trình xử lí tiếp theo sẽ loại bỏ gần như hoàn toàn các hợp chất có tính chất vật lí gần giống như papain [protein, các thành phần gay ức chế hoạt tính enzyme,…]

 Loại bỏ tạp chất bằng pH = 9:

Dịch chiết ở trên được điều chỉnh lên pH bằng 9 bừng dung dịch NaOH 1M.Tủa thu được có thể loại được bằng lọc hoặc bằng ly tâm[2600rpm trong khoảng 1h]. Lấy phần dịch nước trong. Quá trình này loại các tủa gây biến tính protein đã bị loại bỏ và protein có điểm đẳng điện pI=9.

 Quá trình phân đoạn bằng [NH4]2SO4 :

Cho [NH4]2SO4 vào dịch enzym đến 40% độ bão hòa, khuấy nhẹ và để lắng .Sau đó, hỗn hợp được đưa qua thiết bị ly tâm ở chế độ 2500rpm trong 1-2h. Dung dịch [NH4]2SO4 gây biến tính không thuận nghịch với protein [papain]. Thu nhận kết tủa, bỏ dịch lỏng. Tủa dược rửa 1 hoặc nhiều lần bằng dung dich [NH4]2SO4 40% bão hòa.

 Quá trình phân đoạn bằng NaCl :

Hòa tan tủa trong dung dịch Cystein 0.02 M ;tủa papain tạo thành khi thêm từ từ NaCl rắn và khuấy đều . Sau đó, dịch được ly tâm 2500rpm trong 1h để thu kết tủa. Lúc bấy giờ, chúng ta đã gần như thu được papain tinh khiết còn sót lại một số rất ít protein. Cho đến thời điểm bay giờ, chế phẩm này có thể được sử dụng trong công nghệ, nhưng muốn có sản phẩm enzyme thong mại, chúng ta cần thực hiện một số quá trình kết tinh enzyme nhằm nâng cao hoạt tính enzyme. Các quá trình sau quá trình này có vai trò làm tinh khiết enzyme papain.

 Kết tinh:

Tủa được chuyển thành dịch huyền phù trong dung dich Cystein 0.002 M [pH 6.5], giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút sau đó để tinh thể được tạo thành, sau đó duy trì ở 4oC qua đêm , sau đó ly tâm lạnh ở 2500rpmtrong 4-5 h để thu được tinh thể.

 Tái kết tinh :

Hòa tan tinh thể thu được bằng lượng nước cất vừa đủ, sau đó cho thêm nước muối bão hòa vào, khi thể tích đạt 75% nước muối thì có hiện tượng kết tinh. Sau đó để ở nhiệt độ phòng qua đêm rồi ly tâm thu được kết tủa giống như trên. Quá trình kết tinh này có thể được thực hiện nhiều lần để tăng cường mức độ tinh khiết cho sản phẩm enzyme. Số lần tái kết tinh cũng không nên quá nhiều bởi khi kết tinh thì hoạt độ riêng của enzyme sẽ giảm đồng thời khả năng chịu nhiệt của enzyme sẽ giảm đi nếu số lần kết tinh tăng lên.

 Sấy chân không:

Tinh thể tạo được ở bước trên đem sấy chân không nhẹ ở nhiệt độ khoảng 40oC ta thu được papain tinh khiết. Để tăng hoạt tính enzyme, trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể enzyme trong dung dịch đệm phosphate chứa cystein, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0. Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc.

 Hoạt tính của papain:

Papain thủy phân Protein thành các Polypeptit và các Amino acid, nó đóng vai trò vừa như endopeptidase, vừa như exopeptidase. Tính đặt hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có thể thủy phân hầu hết các peptide trừ liên kết của Proline và glutamic acid có nhóm Cacboxyl tự do. Ngoài ra Papain còn có hoạt tính Esterase, Transferase. Papain cần các chất hoạt hóa để thể hiện hoạt tính, thông thường dùng cysteine. Khi có mặt chất này thì nhóm SH của Casein được phục hồi làm tăng hoạt tính Papain. Để thu được hoạt tính mạnh nhất của Papain người ta thường kết hợp dùng Cysteine và EDTA trong đó EDTA đóng vai trò đóng vai trò liên kết với các kim loại nặng có trong nhựa đu đủ. Thông thường Papain bị bất hoạt bởi các chất oxy hóa mạnh [như O2, O3, Cl2, H2O2…]và các ion kim loại nặng : Cd+, Cu2+, Zn2+, và các tác nhân gây ức chế Papain. Điều đáng chú ý là Papain bền với các dung môi hữu cơ

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme:

 Nhiệt độ : Papain chịu được nhiệt độ tương đối cao, dạng nhựa khô papain không bị biến tính sau 3h ở nhiệt độ 90oC , còn ở dạng dung dịch thì papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,5oC. Đáng chú ý là enzym ở dạng mủ, nhựa có độ bền nhiệt cao hơn enzym tinh sạch có lẽ là do các enzym khác trong mủ nhựa có tác dụng bảo vệ nó. Khi thủy phân các Protein khác nhau tùy thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ phản ứng thích hợp cho Papain cũng khác nhau .Đối với cơ chất Cáein thì nhiệt độ tối thích là 37oC.

 pH :

Papain hoạt động trong khoảng pH khá rộng 4.5-8.5, đễ bị biến tính trong môi trường có pH12. Tùy vào cơ chất mà Papain có các pH tối ưu khác nhau. Ví dụ: với Casein pH tối thích là 7 - 7.5, với albumin là 4.5 - 7.1.

 Dung môi:

Papain không thay đổi góc quay quang học trong methanol 70% và không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%. Chất gây biến tính mạnh nhất với Papain là TCA [với nồng độ 10% đã làm biến tính bất thuận nghịch enzyme.

II.2.1.4. Thu nhận enzyme ficin

Ficin là một loại protease thực vật trong cấu trúc bậc I có chứa nhóm sulfhydryl [-SH]. Trình tự các amino acid ở gần trung tâm phản ứng gần giống với papain và bromelin. Enzyme ficin dược thu nhận từ dịch nhựa tươi từ cây sung. Quá trình sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung thành chế phẩm enzyme ficin gồm các bước sau: Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất. Khuấy đều dung dịch bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzyme ficin hòa tan hoàn toàn trong nước. Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 3.000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống. Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên. Dùng phương pháp tủa phân đoạn enzyme bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzyme trong các phân đoạn. Nhũng phân đoạn có hoạt tính enzyme được đưa qua lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn enzyme. Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lại hoạt tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400C. Chế phẩm enzyme thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0– 40C.

Aug 06, 2011#52011-08-06T04:41

II.2.2. Thu nhận enzyme từ nguồn động vật: Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim,… những phế liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzym rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa amilase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzym khác. Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, rennin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Rennin là chế phẩm enzim có giá trị lớn trong công nghiệp. Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzim không lớn lắm. Các nguyên liệu này có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.

II.2.2.1. Enzim protease

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật [heo, bò, bê..]. Ngoài ra có 3 protease kiềm quan trọng là: Pacreatin, Trypsin, Chymotrypsin.

II.2.2.2. Enzyme Pepsin

Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo pepton có trọng lượng phân tử nhỏ.

 Thành phần cấu tạo

Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin thô [heo] chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin. Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu, là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Số lượng các amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực là lớn, làm cho enzim dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0.1N.

 Đặc tính

 Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsin

Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức pesinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành pepsin. Toàn bộ quá trình tạo thành pepsin từ pepsinogen có thể biểu diễn như sau:

 Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin

Pepsin là enzim quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn, chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo. Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein, tạo thành chủ yếu những pepton, có ít hay không có amino acid tự do.

 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin

• Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease, hoạt động ở vùng pH 1- 4, pH thích hợp khoảng 1.5–2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi. • Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Ở 70oC mất khả năng tiêu đạm. • Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. Trong đó, HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất, kế đến là HNO3, HBr, H3PO4, các acid lactic, formic, gây tác động kém. • Các muối lim loại nặng như Hb, Hg, Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến tính enzim. • Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.

 Các phương pháp thu nhận pepsin

 Thu nhận dung dịch pepsin Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme. Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày của động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng [theo Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966] hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid [theo Covalenco, 1966]. Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu suất thu enzym cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần [theo Teply và cộng sự,1980]. Nguyên nhân là do phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào. Mặt khác, phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin, ta còn thu đựơc pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày trong sản xuất. Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn. • Phương pháp chiết: Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol hay glyceryl, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng etanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường. • Phương pháp tự phân: Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Theo nhiều thực nghiệm, việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Nguyên nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị. Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C. Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzym trên một chất kết tủa. Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo [ngâm nước] có mặt H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang đi thẩm tích [dialyz]. Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc [phương pháp Bruché]

 Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết

• Phương pháp tủa. Phương pháp tủa bằng muối [diêm tích]: Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch các enzym mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzym. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng độ muối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau. Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như [NH¬4]2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin. Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzym, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzym trong khi sấy, thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân không. Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 950C hay aceton [tỷ lệ 1:3] [Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0 – 30C]. Sau đó ly tâm, sấy tủa ở nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 – 50C để đảm bảo hoạt tính của enzym. Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản lạnh đông trước khi thực hiện [0 – 30C]. Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trứơc khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ màng nhày bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức ăn thừa [rửa bằng tay] không làm tổn thất lớp màng nhầy chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy. Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất. Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0.5% với tỷ lệ [theo khối lượng] 1: 2 và nhiệt độ 40- 500C, khuấy đều; thời gian 24 – 48 giờ. Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch. Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat, cồn 85%, aceton, izopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000. Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm mất hoạt tính enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤ 50C. Tác nhân PEG 6000: [tương tự như muối vô cơ]. Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzym và khuấy liên tục cho tan hết. Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 - 15 phút với tốc độ 5000 – 6000 vòng/phút. Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 400C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzym các chất độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin… trong quá trình sấy. Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân vật lý, hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym. • Phương pháp hấp phụ Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzym. Cơ sở khoa học của phương pháp này là cho enzym hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin, oxit sắt, than… Sau đó, dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzym ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzym mong muốn. Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. Bổ sung NH4OH 0.1N vào dung dịch pepsin thô cho đến phản ứng kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp photphat gồm: dung dịch CaCl2 10%, dung dịch dinatriphotphat 5.5% với tỷ lệ 1:1. Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH và được hấp phụ trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng xuống. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với nước cất. Tiếp theo, lấy tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%, tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin tan trong dung dịch, lọc lấy dung dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2.4 – 2.6. Sau đó, thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete [tỷ lệ 1:1] để tủa pepsin. Kết tủa thu đựơc rửa với cồn, rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤ 450C. • Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C, áp suất thấp để enzym không bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm đặc, sau đó được trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng bột khô. Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng nhày và trữ ở trạng thái đông, rồi đưa đến pH = 2.7 – 2.9 bằng HCl và đựơc ủ ở 500C trong vài giờ. Dịch thủy phân được trộn đều và để yên phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt, để lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất thấp, enzym bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra. Sau khi pepsin bị tủa bằng alcohol, đem lọc và làm khô. Các phương pháp chiết tách trên đều cho phép thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin này hoàn toàn có thể sử dụng điều trị trong y học hay trong công nghiệp.

 Phương pháp tinh sạch pepsin

 Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop[/i]: Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis, lấy dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào, chất kết tủa được rửa sạch với dung dịch MgSO4, sau đó hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách gia thêm H2SO4 N/2 pha loãng trong nước 450C, sau một lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính cao.

 Phương pháp lọc qua gel sephadex:

Nguyên tắc Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương nước, những phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di động ở ngoài gel, do đó di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Còn những phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Do đó những kỹ thuật này dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh, phân tử lượng càng nhỏ ra càng chậm. Hóa chất và dụng cụ: Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng gel sephadex thích hợp. Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm, cao 35cm và gel sepphadex G-100, cân 1.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0.028 trong 72 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaNO¬3 đựơc rửa sạch bằng nước cất sau đó nhồi vào cột, hay dùng gel sepphadex G-75. Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 2.2. Cách pha đệm p.H 2.2: X: dung dịch acid citric 0.1M [hòa tan 21,008g acid citric trong 1 lít nứơc cất], Y: dung dịch dianatri hydrophotphat 0.2M [hòa tan 35.6 g Na2HPO4.2H2O hay 71.7g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nứơc cất]. Pha 98 ml dung dịch X và 2 ml dung dịch Y, ta có dung dịch đệm pH = 2.2. Chọn cột có  = 1.8 cm, chiều cao h = 80cm. Kỹ thuật nhồi cột Cột sau khi rửa sạch [rửa cột để đổ gel]: cột đựơc rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, đem sấy khô. Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dịch sulfo cromic trong một ngày, rửa sạch lại, tráng nước cất rồi sấy khô. Tiến hành nhồi cột với G- 75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và phân lớp. Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho dung dịch đệm chảy ra từ từ. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt độ cao cần thiết. Bề mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm cao khoảng 2 cm để gel không bị khô. Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó rửa cột bằng dung dịch đệm p H = 2.2 khoảng 24 giờ [ thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng 3 lần thể tích cột]. Đưa mẫu vào cột Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua lọc bằng 283 ml cồn 85%. Sau đó ly tâm, kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50 ml dung dịch đệm pH 2.2 ta thu được dung dịch A. Hút 3 ml dung dịch A, thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH 2.2, đem ly tâm bỏ cặn. Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt gel thì cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột là 5 ml [từ 1 – 5% thể tích cột.]. Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm chảy qua cột. Thu mẫu qua cột Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Số phân đoạn làn ống [ví dụ khoảng 30 ống], mỗi phân đoạn ta thu khoảng 4 ml, các phân đoạn thu được, đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm. Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng, ghi nhận các peak chính được tạo thành. Sau đó xác định hoạt tính pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Theo kết quả tính hiệu suất về hoạt tính enzym và hàm lượng protein thu được qua lọc gel. • Ví dụ: Một số phương pháp và kết quả thu nhận tinh sạch pepsin dê. Tinh sạch pepsinogen: pepsinogen là dạng zymogen của pepsin, là enzym chính trong dạ dày. Có hai loại chính pepsinogen A và C được biết đến ở hoạt động ở động vật trưởng thành. Dạ dày dê đựơc cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Tất cả những tiến trình trên đựơc thực hiện ở 0-40C, ngoại trừ FPLC thực hiện ở nhiệtt độ phòng. Sắc ký trên DEAE- Sephacel là lọc gel được thực hiện trong đệm Na2SO4 0.01M, pH 7.0 [Thực hiện FPLC trong đệm Tris-HCl 0.01M, p H 7.0]. Bản chất những tiến trình dùng tinh sạch pepsinogen Suncus [chuột xạ nhà] và được mô tả sau đây: Phần múi khế của dạ dày [tổng khối lượng trung bình 6.1g] được đồng hóa với 20 ml đệm Na2SO4¬ 0.01M, dung dịch đồng nhất đựoc ly tâm ở 15.000 vòng/phút. Phần bên trên đem tiến hành qua cột DEAE- Sephacel [1.5 x 30cm]. Protein đã hấp phụ được giải phóng theo thiều gradient nồng độ của NaCl từ 0- 0.5M. Hoạt động thủy phân Hb được phát hiện tạo thành ba peak. Peak I chứa loại pepsinogen C và peak II, III chứa pepsinogen A. Protein của mỗi peak sau khi qua lọc gel tren cột sephadex G-100 [1.5 x 100cm]. Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột mono Q, HR 5/5 để tinh sạch lần cuối. Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 0- 0.5M hơn 30 phút ở mức chảy thấp 1.0 mol/phút. Hỗn hợp pepsinogen A và C được phân tách hoàn toàn chia ra từng loại isozymogen. Điện di các protein: pepsinogen đã tinh sạch được thực hiện để không biến tính dựa theo phương pháp PAGE [polyacrtlamyl gel electrophoresis] của Ornstein và Davis, và SDS-PAGE theo Weber và osborn. Protein được nhuộm bằng Coomassie briliiant blue. Deglycozyl hóa: mỗi pepsinogen [khoảng 0.2 µg] được ủ với 1 đơn vị tối thiểu của glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, việc làm giảm khối lượng của pepsinogen được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen C-2 suncus được sử dụng như một kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen. Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch các enzym ở mỗi bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry và cộng sự và đo ở bước sóng 280nm với serum albumin heo như một tiêu chuẩn. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch được xác định bằng cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối lượng phân tử. Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid [10µg protein] bị thủy phân bằng HCl bay hơi ở 1500C/1giờ ở hệ thống Water PICCO- TAGTM Worj Station [Millipore Corp, Milford, MA]. Mẫu được phân tích bằng máy phân tích amino acid.

Aug 06, 2011#62011-08-06T04:47

II.2.2.3. Enzyme Rennin Rennin là enzim đông tụ sữa, đựơc tìm thấy ở dịch tiêu háo của ngăn thứ tư dạ dày bê.

Thành phần cấu tạo

Renin chứa nhiều amino acid- acid tính hơn amino acid -kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn pepsin.

 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin

Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4.5. Rennin là enzim thuỷ phân liên kết peptide trong protein, và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt tác động mạnh lên các liên kết tạo bởi tyrosine và phenylalamine. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH.

 Sự hoạt hoá prorennin

Trong môi trường acid ở pH = 5 sự hoạt hoá prorennin thành rennin xảy ra không đáng kể, nhưng ở pH < 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh.

 Các yếu tố ảnh hưởng

PH tối ưu của rennin pH = 3.7. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH 3.7 các ion làm tăng hoạt độ rennin, những cation hoá trị +1 làm giảm hoạt tính của nó. Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H2¬S 0.0001M và MgCl2. Nguyên liệu: ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi. Lấy phần múi khế của bao tử và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, rửa nhẹ bằng nước lạnh, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. Hoá chất: Muối NaCl, HCl sử dụng để thu tủa enzim phải tinh khiết, khô không lẫn tạp chất, đặc biệt là kim loại nặng vì gây tủa và vô hoạt enzym. Natribenzoat: chất bảo quản. Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hoá, máy đo pH. Phương pháp thu nhận: có 2 cách • Cách 1: Dạ dày xay nhuyễn, HCl 0.2%, bổ sung 0.7% acid boric trên tổng V với tỷ lệ 1:3 theo V. • Cách 2: Dạ dày xay nhuyễn, nước muối 10% chỉnh HCl pH = 4  tỷ lệ 1:3 theo thể tích. Cho 0.7% acid boric trên tổng V [tác dụng bảo quản]. Giữ ở 35 – 400C cả 2 mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đó dùng HCl chỉnh pH = 4. Lấy ra đem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thô có chứa rennin. Dịch rennin được kết tủa bằng cách acid hoá dung dịch hoặc bão hòa với NaCl. Gelatin thường xuyên được thêm vào để giúp kết tủa vá tách renin ra khỏi dung dịch bằng sự ly tâm 45 phút ở 5.000 vòng/ phút. • Thu rennin dạng bột Tiến hành tủa enzim theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch thô một lượng NaCl khoảng 22 – 23% cho đến khi bão hoà NaCl. Để tủ lạnh 20 phút Lấy ra ly tâm lọc. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri, sấy khô rồi để vào bình hút ẩm. Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion. Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn. Cân chính xác một lượng enzim bột vào túi colodion [cellophane]. Cân trọng lượng túi có chứa enzym, cho túi vào becher đựng nước cất và cho thẩm tích trong môi trường nứơc lạnh 0 – 40C. Khuấy và thay đổi nước lạnh thường xuyên [ hai ngày đêm] làm khô nhanh túi bằng cách sấy quạt gió, nhiệt độ 30 - 400C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô. • Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl: m1 – m2 = m m1: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích [g] m2: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm sau thẩm tích [g] m: Trọng lượng muối NaCl đã thẩm tích qua màng [g] Tinh sạch rennin: Rennin được chiết và làm sạch bằng sắc ký DEAE- Sephadex. Tái chế: tách enzim từ nước sữa [dung dịch còn lại sau khi tách phần đông tụ] và tái sử dụng bằng phương pháp sắc ký.

II.2.2.4. Enzyme Pacreatin

Pancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường trích pancreatin tuỵ tạng của heo.

 Thành phần

Pancreatin là hệ enzym thuỷ phân xúc tác các phản ứng chuyển hoá đạm, đường, chất béo và một số chất khác ở trong ruột.

 Tính chất Pancreatin

Pancreatin có hoạt tính mạnh nhất trong môi trường kiềm và bị bất hoạt trong môi trường acid mạnh và nó hoạt động mạnh nhất từ 2 -3 giờ sau khi ăn để thực hiện quá trình tiêu hoá ở ruột non. Pancreatin có thể pepton hoá nhiều loại thức ăn như sữa, thịt, cháo… và chuyển dầu, chất béo thành dạng nhũ tương để dễ tiêu hoá.

 Thu nhận pancreatin

• Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi đã được bảo quản, cân trong lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với troïng lượng tuỵ tươi. Sau đó đem sấy ở những nhiệt độ 500C, 600C, 700C. Sau một thời gian sấy thì đem xay nhuyễn và được chế phẩm pacreatin thô. • pacreatin Sơ đồ thu nhận bằng phương pháp tách chiết với aceton

Aug 06, 2011#72011-08-06T05:20

xin hỏi nhóm là các phương pháp hóa học, sinh học, vật lý thì phương pháp nào tối ưu hơn? ;]

Aug 06, 2011#82011-08-06T05:41

chào hưng mình xin trả lời câu hỏi của bạn.
tùy mỗi mục đích và công đoạn khác nhau ta chọn phương pháp thích hợp, ví dụ như khi ta cần phá vỡ tế bào thì phải dùng phương pháp vật lý, sau đó muốn chiết tách thì ta phải dùng đến các dung môi hữu cơ hoặc phương pháp điện di trên cột gel.

Aug 06, 2011#92011-08-06T05:46

II.2.2 phương pháp thu nhân enzyme từ động vật [+] SpoilerTrong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhày dạ dày, tim,… những phế liệu của công nghiệp thịt dùng để tách enzyme rất tiện lợi. Dịch tụy có chứa amilase, lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác. Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê người ta thu chế phẩm rennin để làm đông sữa trong sản xuất phomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật. Khác với pepsin, rennin có khả năng đông tụ sữa cao mà không thuỷ phân sâu sắc casein. Rennin là chế phẩm enzyme có giá trị lớn trong công nghiệp.

Tuy vậy, để sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và trong nền kinh tế quốc dân, protease động vật ít thuận lợi do sản xuất chúng bị hạn chế và lượng nguyên liệu để thu enzyme không lớn lắm. Các nguyên liệu này có thể dùng trong nhiều lĩnh vực khác.

II.2.2.1.Enzyme protease [+] SpoilerHai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hoá ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzyme này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật [heo, bò, bê..]. Ngoài ra có 3 protease kiềm quan trọng là: Pacreatin, Trypsin, Chymotrypsin. II.2.2.2.Enzyme Pepsin [+] SpoilerPepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt các liên kết peptide của protein. Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acid riêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein tạo pepton có trọng lượng phân tử nhỏ.
 Thành phần cấu tạo Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Ở heo thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin thô [heo] chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin. Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành hình cầu, là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Số lượng các amino acid có mạch nhánh không kỵ nước phân cực là lớn, làm cho enzyme dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực. Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0.1N.

 Đặc tính

Chế phẩm pepsin [dược phẩm] tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt [Dược điển Việt Nam]. Điểm đẳng điện của pepsin gần pH = 1. Pepsin thuỷ phân protein trong vùng acid khá rộng pH =1 - 4, pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tuỳ theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH = 1.8 – 2.2. Pepsin bền nhất ở pH = 4 - 5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzyme có phần thay đổi giảm đi. Từ pH = 5.5 trở lên pepsin không hoạt động.  Sự hoạt hoá pepsinogen thành pepsin Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức pesinogen bất hoạt. Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin, pepsinogen sẽ được hoạt hoá thành pepsin. Tính đặc hiệu và khả năng thuỷ phân protein của pepsin Pepsin là enzyme quan trọng nhất của tuyến dịch vị được tiết vào dạ dày. Nhiệm vụ chủ yếu là phân cắt sơ bộ protein thức ăn, chuyển sang dạng thích hợp để chuẩn bị cho những quá trình tiêu hoá triệt để tiếp theo. Pepsin xúc tác sự thuỷ phân giải protein, tạo thành chủ yếu những pepton, có ít hay không có amino acid tự do.

 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin

•Ảnh hưởng của pH: Pepsin là một protease, hoạt động ở vùng pH = 1- 4, pH thích hợp khoảng 1.5–2.4. Đối với mỗi cơ chất thì pH có thể thay đổi. •Ảnh hưởng của nhiệt độ: Pepsin hoạt động ở nhiệt độ tối ưu khoảng 40 – 50oC. Ở 70oC mất khả năng tiêu đạm. •Ảnh hưởng của các loại muối và các dung môi hữu cơ: Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm như NaHCO3 làm chậm sự pepton hoá của pepsin. Trong đó, HCl là acid gây ra sự thuỷ phân mạnh nhất, kế đến là HNO3, HBr, H3PO4, các acid lactic, formic, gây tác động kém. •Các muối kim loại nặng như Hb, Hg, Pt ở nồng độ thấp vẫn gây kết tủa và làm biến tính enzyme. •Các dung môi hữu cơ ít phân cực làm giảm hoạt tính của pepsin.

 Các phương pháp thu nhận pepsin

 Thu nhận dung dịch pepsin Bản chất của quá trình chiết tách pepsin từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình: phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme. Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày của động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng [theo Konne và Muraviep, 1960; Covalines và cộng sự, 1966] hay nhờ sự tự phân trong môi trường acid [theo Covalenco, 1966]. Khi so sánh sự thu nhận pepsin của hai phương pháp cho thấy phương pháp tự phân cho hiệu suất thu enzyme cao hơn phương pháp chiết là 5 – 7 lần [theo Teply và cộng sự,1980]. Nguyên nhân là do phương pháp tự phân có sự phá vỡ một cách triệt để cấu trúc tế bào. Mặt khác, phương pháp tự phân còn có ưu điểm là cùng với pepsin, ta còn thu đựơc pepton, tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu protein của dạ dày trong sản xuất. Muốn pepsin có hoạt tính cao thì phải cách ly từ niêm mạc dạ dày lấy từ động vật mới mổ hoặc có thể bảo quản niêm mạc ở nhiệt độ lạnh 0-240C trong thời gian ngắn.

•Phương pháp chiết:

Dạ dày rửa sạch, tách màng nhầy, nghiền, ngâm vào nước có 5% butanol hay glyceryl, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằng ethanol để pepsin kết tủa. Thời gian ngâm 48 – 72 giờ, nhiệt độ thường.

•Phương pháp tự phân:

Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heo mới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H3PO4, H2SO4 với nồng độ thích hợp để chiết xuất và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin. Theo nhiều thực nghiệm, việc dùng HCl để điều chỉnh pH môi trường sẽ cho hoạt tính cao nhất. Nguyên nhân là do HCl là acid vô cơ quan trọng có trong thành phần dịch vị dạ dày động vật, trong cơ thể sống pepsinogen được hoạt hóa thành pepsin nhờ HCl dịch vị. Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40 – 420C. Ngoài ra một số tác giả đã sử dụng nguyên lý hấp thụ enzyme trên một chất kết tủa. Cho hình thành chất kết tủa phosphattricalci từ niêm mạc dạ dày heo [ngâm nước] có mặt H3PO4. Sau đó chất kết tủa được hòa tan bằng HCl và dung dịch thu được mang đi thẩm tích [dialyz]. Dung dịch pepsin thô thu được sau khi xử lý bằng ester sẽ thu lại chất cặn có thành phần cấu tạo là pepsin sơ lọc [phương pháp Bruches]

 Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết

•Phương pháp tủa. Phương pháp tủa bằng muối [diêm tích]: Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch các enzyme mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzyme. Các protein khác nhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch. Do đó khi tăng dần nồng độ muối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau. Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như [NH¬4]2SO4, NaCl… ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin. Ly tâm lấy tủa, trộn với tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có tính chất ổn định enzyme, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzyme trong khi sấy, thường sấy ở nhiệt độ ≤ 450C hay sấy kèm chân không. Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ: Với dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 450C đến khi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 950C hay aceton [tỷ lệ 1:3] [Có thể tủa bằng cồn cao độ hay các dung môi hữu cơ thích hợp như: metylic, etylic, aceton ở nhiệt độ gần 0 – 30C]. Sau đó ly tâm, sấy tủa ở nhiệt độ ≤ 450C. Phương pháp tủa cần đựơc tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 – 50C để đảm bảo hoạt tính của enzym. Nguyên liệu: Dạ dày động vật tươi vừa mới giết mổ; bảo quản lạnh đông trước khi thực hiện [0 – 30C]. Tách màng nhầy: rửa sạch bên ngoài trước khi lộn ngược dạ dày, rửa thật nhẹ màng nhày bằng nước lạnh chỉ để loại bỏ thức ăn thừa [rửa bằng tay] không làm tổn thất lớp màng nhầy chứa pepsin và tiến hành bóc màng nhầy. Xay nhuyễn: màng nhầy dạ dày sau khi tách cắt nhỏ và xay nhuyễn đồng nhất. Tự phân: màng nhầy sau khi xay bổ sung dung dịch HCl 0.5% với tỷ lệ [theo khối lượng] 1: 2 và nhiệt độ 40- 500C, khuấy đều; thời gian 24 – 48 giờ. Lọc: vớt bỏ hết lớp mỡ phía trên mặt, sau đó lọc qua nhiều lớp vải mùn thu dung dịch. Kết tủa: kết tủa bằng NaCl nồng độ bão hòa 25%. Cho muối từ từ, khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch bão hòa, để yên dịch thủy phân 30 phút. Có thể dùng các tác nhân tủa như: amon sulphat, cồn 85%, aceton, izopropanol, polyetylenglycol – PEG 6000. Trong quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ sinh ra một nhiệt lượng lớn, có thể làm mất hoạt tính enzym. Do đó, dung dịch sau tự phân đựơc lọc cùng dung môi đã làm lạnh và dung môi phải được cho từ từ và khuấy liên tục để tránh sự tăng nhiệt độ cục bộ bên trong hỗn hợp. Thời gian 5 – 10 phút, nhiệt độ ≤ 50C. Tác nhân PEG 6000: [tương tự như muối vô cơ]. Cho PEG dạng rắn cho từ từ vào dung dịch enzyme và khuấy liên tục cho tan hết. Ly tâm: hỗn hợp dung dịch sau khi kết tủa để yên đem ly tâm 10 - 15 phút với tốc độ 5000 – 6000 vòng/phút. Sấy khô: sau khi ly tâm thu phần kết tủa, đem sấy khô có thổi khí ở nhiệt độ 30 – 400C hoặc sấy chân không hay thiết bị sấy đông khô. Để tránh bị mất hoạt tính ngừơi ta trộn thêm vào chế phẩm enzyme các chất độn như tinh bột hòa tan, maltose dextrin… trong quá trình sấy. Bảo quản: chế phẩm pepsin thô cần đựơc bảo quản ở điều kiện khô, kín, lạnh, tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng và các tác nhân vật lý, hóa học có thể ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme. •Phương pháp hấp phụ Có thể dùng một số chất hấp phụ đặc hiệu để hấp phụ enzyme. Cơ sở khoa học của phương pháp này là cho enzyme hấp phụ chọn lọc lên các chất hấp phụ như: caolin, oxit sắt, than… Sau đó, dùng các chất giải hấp phụ đặc biệt để tách enzyme ra khỏi chất hấp phụ và thu nhận enzyme mong muốn. Ví dụ: Phương pháp hấp phụ Pepsin. Bổ sung NH4OH 0.1N vào dung dịch pepsin thô cho đến phản ứng kiềm nhẹ, rồi thêm hỗn hợp photphat gồm: dung dịch CaCl2 10%, dung dịch dinatriphotphat 5.5% với tỷ lệ 1:1. Pepsin được kết tủa từ từ nhờ dung dịch NH4OH và được hấp phụ trên mặt mỏng của tricalciphosphat và cùng với tricalciphosphat lắng xuống. Để sự nhả hấp phụ không xảy ra, người ta cần tiếp tục cho NH4OH để giữ môi trường phản ứng cần thiết, lọc lấy tủa và rửa với nước cất. Tiếp theo, lấy tủa xử lý với dung dịch oxalic acid 4%, tricalciphosphat sẽ chuyển thành calcioxalat không tan, pepsin tan trong dung dịch, lọc lấy dung dịch pepsin. Dùng NH4OH để điều chỉnh đến pH = 2.4 – 2.6. Sau đó, thêm 5 thể tích hỗn hợp cồn: ete [tỷ lệ 1:1] để tủa pepsin. Kết tủa thu đựơc rửa với cồn, rồi với ete và sấy khô ở nhiệt độ ≤ 450C. •Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc Với phương pháp này người ta tiến hành ở nhiệt độ ≤ 450C, áp suất thấp để enzyme không bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô sẽ đậm đặc, sau đó được trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo dạng bột khô. Ví dụ: Pajagopalanetal thực hiện xử lý dạ dày heo bằng cách tách màng nhày và trữ ở trạng thái đông, rồi đưa đến pH = 2.7 – 2.9 bằng HCl và được ủ ở 500C trong vài giờ. Dịch thủy phân được trộn đều và để yên phần nhẹ hơn sẽ nổi lên trên bề mặt, để lạnh 40C và cô đặc dưới áp suất thấp, enzyme bị tủa bởi alcohol và đựơc tách ra. Sau khi pepsin bị tủa bằng alcohol, đem lọc và làm khô. Các phương pháp chiết tách trên đều cho phép thu chế phẩm pepsin chưa tinh khiết, có lẫn protein lạ và các protease khác. Pepsin này hoàn toàn có thể sử dụng điều trị trong y học hay trong công nghiệp.

 Phương pháp tinh sạch pepsin

 Phương pháp kết tinh pepsin của Northrop: Northrop đã bắt đầu từ dung dịch pepsin tinh sạch của Parke và Davis, lấy dung dịch này cho kết tủa bằng dung dịch sulfuric với MgSO4 bán bão hào, chất kết tủa được rửa sạch với dung dịch MgSO4, sau đó hòa tan bằng dung dịch NaOH N/2, rồi lại cho kết tủa lần 2 bằng cách gia thêm H2SO4 N/2 pha loãng trong nước 450C, sau một lần làm lạnh nữa, tinh thể pepsin xuất hiện và phải qua một loạt các quy trình hòa tan trong kiềm và tái kết tủa trong dung dịch acid sẽ điều chế được tinh thể pepsin hoàn toàn tinh khiết và hoạt tính cao.  Phương pháp lọc qua gel sephadex: Nguyên tắc Khi cho một hỗn hợp nhiều chất chảy qua cột chứa gel sephadex đã trương nước, những phân tử nào lớn sẽ không chui vào trong hạt gel đựơc mà chỉ di động ở ngoài gel, do đó di chuyển ra khỏi cột sephadex nhanh. Còn những phần tử nhỏ hơn chui vào trong các hạt với mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng. Do đó những kỹ thuật này dùng để tách các chất có phân tử lượng khác nhau, phân tử lượng càng lớn ra khỏi cột càng nhanh, phân tử lượng càng nhỏ ra càng chậm. Hóa chất và dụng cụ: Tùy theo đặc điểm cột và loại gel sephadex dùng trong thí nghiệm mà ta ngâm một lượng gel sephadex thích hợp. Ở đây dùng 1 buret có đường kính 1 cm, cao 35cm và gel sepphadex G-100, cân 1.2g gel ngâm trong 1 lượng thừa dung dịch NaNO3 0.028 trong 72 giờ để gel trương nở hoàn toàn. Gel sau khi ngâm NaNO¬3 đựơc rửa sạch bằng nước cất sau đó nhồi vào cột, hay dùng gel sepphadex G-75. Dung dịch đệm Mc Ilvaine pH = 2.2. Cách pha đệm pH = 2.2: X: dung dịch acid citric 0.1M [hòa tan 21,008g acid citric trong 1 lít nứơc cất], Y: dung dịch dianatri hydrophotphat 0.2M [hòa tan 35.6 g Na2HPO4.2H2O hay 71.7g Na2HPO4.12H2O trong 1 lít nứơc cất]. Pha 98 ml dung dịch X và 2 ml dung dịch Y, ta có dung dịch đệm pH = 2.2. Chọn cột có  = 1.8 cm, chiều cao h = 80cm. Kỹ thuật nhồi cột Cột sau khi rửa sạch [rửa cột để đổ gel]: cột được rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton, đem sấy khô. Rửa các dụng cụ khác: các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dịch sulfo cromic trong một ngày, rửa sạch lại, tráng nước cất rồi sấy khô. Tiến hành nhồi cột với G- 75 đã trương nở hoàn toàn: gel được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ và tránh tạo bọt khí và phân lớp. Sau khi đã cho một ít gel lắng thành lớp cao khoảng 5 cm mới mở khóa cho dung dịch đệm chảy ra từ từ. Sau đó tiếp tục cho gel vào cột cho đến khi đạt độ cao cần thiết. Bề mặt dung dịch bên trên của cột phải phẳng, trên mặt gel luôn có một lớp dung dịch đệm cao khoảng 2cm để gel không bị khô. Khóa ống mao dẫn lại, để cột gel ổn định trong 3 giờ, sau đó rửa cột bằng dung dịch đệm p H = 2.2 khoảng 24 giờ [thể tích dung dịch đệm dùng để rửa gấp khoảng 3 lần thể tích cột]. Đưa mẫu vào cột Đem kết tủa 50 ml dung dịch enzym thu đựơc sau quá trình tự phân đã qua lọc bằng 283ml cồn 85%. Sau đó ly tâm, kết tủa đựơc hòa tan lại bằng 50 ml dung dịch đệm pH = 2.2 ta thu được dung dịch A. Hút 3 ml dung dịch A, thêm vào khoảng 2 ml dung dịch đệm pH = 2.2, đem ly tâm bỏ cặn. Ngưng khóa dòng dung dịch đệm chảy qua cột, khi lớp dung dịch đệm vừa cạn đến mặt gel thì cho mẫu vào cột, lượng mẫu cho vào cột là 5 ml [từ 1 – 5% thể tích cột]. Sau khi cho mẫu vào cột hết thì tiếp tục cho dung dịch đệm chảy qua cột. Thu mẫu qua cột Sau khi mẫu đã vào hết trong cột, bắt đầu hứng dung dịch chảy qua cột. Số phân đoạn làn ống [ví dụ khoảng 30 ống], mỗi phân đoạn ta thu khoảng 4 ml, các phân đoạn thu được, đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 280nm. Vẽ đồ thi biểu diễn mối quan hệ giữa từng phân đoạn và giá trị OD tương ứng, ghi nhận các peak chính được tạo thành. Sau đó xác định hoạt tính pepsin của các ống tương ứng với peak chính. Theo kết quả tính hiệu suất về hoạt tính enzyme và hàm lượng protein thu được qua lọc gel. •Ví dụ: Một số phương pháp và kết quả thu nhận tinh sạch pepsin dê. Tinh sạch pepsinogen: pepsinogen là dạng zymogen của pepsin, là enzyme chính trong dạ dày. Có hai loại chính pepsinogen A và C được biết đến ở hoạt động ở động vật trưởng thành. Dạ dày dê đựơc cắt nhỏ để tiến hành tinh sạch. Tất cả những tiến trình trên đựơc thực hiện ở 0 - 40C, ngoại trừ FPLC thực hiện ở nhiệt độ phòng. Sắc ký trên DEAE- Sephacel là lọc gel được thực hiện trong đệm Na2SO4 0.01M, pH = 7.0 [Thực hiện FPLC trong đệm Tris-HCl 0.01M, p H = 7.0]. Bản chất những tiến trình dùng tinh sạch pepsinogen Suncus [chuột xạ nhà] và được mô tả sau đây: Phần múi khế của dạ dày [tổng khối lượng trung bình 6.1g] được đồng hóa với 20 ml đệm Na2SO4¬ 0.01M, dung dịch đồng nhất đựoc ly tâm ở 15.000 vòng/phút. Phần bên trên đem tiến hành qua cột DEAE- Sephacel [1.5 x 30cm]. Protein đã hấp phụ được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của NaCl từ 0- 0.5M. Hoạt động thủy phân Hb được phát hiện tạo thành ba peak. Peak I chứa loại pepsinogen C và peak II, III chứa pepsinogen A. Protein của mỗi peak sau khi qua lọc gel tren cột sephadex G-100 [1.5 x 100cm]. Dung dịch protein được thực hiện FPLC trên một cột mono Q, HR 5/5 để tinh sạch lần cuối. Protein được giải phóng theo chiều gradient nồng độ của muối NaCl từ 0 - 0.5M hơn 30 phút ở mức chảy thấp 1.0 mol/phút. Hỗn hợp pepsinogen A và C được phân tách hoàn toàn chia ra từng loại isozymogen. Điện di các protein: pepsinogen đã tinh sạch được thực hiện để không biến tính dựa theo phương pháp PAGE [polyacrtlamyl gel electrophoresis] của Ornstein và Davis, và SDS-PAGE theo Weber và osborn. Protein được nhuộm bằng Coomassie briliiant blue. Deglycozyl hóa: mỗi pepsinogen [khoảng 0.2 µg] được ủ với 1 đơn vị tối thiểu của glycopeptidase F dựa theo công thức sản xuất, việc làm giảm khối lượng của pepsinogen được phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE. Pepsinogen C-2 suncus được sử dụng như một kiểm chứng dương tính quá trình glycozyl hóa pepsinogen. Xác định nồng độ protein: nồng độ của protein trong dung dịch các enzyme ở mỗi bước tinh sạch được xác định bởi phương pháp Lowry và cộng sự và đo ở bước sóng 280nm với serum albumin heo như một tiêu chuẩn. Số lượng pepsinogen đã tinh sạch được xác định bằng cách tính hệ số tiêu hủy phân tử từ thành phần amino acid và khối lượng phân tử.

Phân tích amino acid: mẫu để phân tích amino acid [10µg protein] bị thủy phân bằng HCl bay hơi ở 1500C/1giờ ở hệ thống Water PICCO- TAGTM Worj Station [Millipore Corp, Milford, MA]. Mẫu được phân tích bằng máy phân tích amino acid.

II.2.2.3.Enzyme Rennin [+] SpoilerRennin là enzim đông tụ sữa, được tìm thấy ở dịch tiêu háo của ngăn thứ tư dạ dày bê.
 Thành phần cấu tạo Renin chứa nhiều amino acid- acid tính hơn amino acid -kiềm tính, nhưng tỷ lệ thấp hơn pepsin.

 Đặc tính và khả năng thuỷ phân của rennin

Rennin tinh khiết có những đặc tính của một globulin. Điểm đẳng điện của rennin pI = 4.5. Rennin là enzyme thuỷ phân liên kết peptide trong protein, và không làm ảnh hưởng đến liên kết ester và amine. Rennin đặc biệt tác động mạnh lên các liên kết tạo bởi tyrosine và phenylalamine. Rennin tác động lên cơ chất casein của sữa bò và những loại sữa khác. Đặc tính thuỷ phân của rennin phụ thuộc rất nhiều vào pH.  Sự hoạt hoá prorennin Trong môi trường acid ở pH = 5 sự hoạt hoá prorennin thành rennin xảy ra không đáng kể, nhưng ở pH < 3 thì quá trình này xảy ra rất mạnh.

 Các yếu tố ảnh hưởng

pH tối ưu của rennin pH = 3.7. Đặc điểm của rennin là tác động ở môi trường acid vừa phải và cần có sự hiện diện Ca2+. Ở pH = 3.7 các ion làm tăng hoạt độ rennin, những cation hoá trị +1 làm giảm hoạt tính của nó. Chất kìm hãm có tác dụng hiệu quả nhất lên rennin là dung dịch H2¬S 0.0001M và MgCl2. Nguyên liệu: ngăn thứ tư dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi. Lấy phần múi khế của bao tử và lộn ngược một cách nhẹ tay để bỏ hết thức ăn dư, tách bỏ phần mỡ, rửa nhẹ bằng nước lạnh, sau đó rửa bằng dung dịch muối NaCl 15%. Hoá chất: Muối NaCl, HCl sử dụng để thu tủa enzyme phải tinh khiết, khô không lẫn tạp chất, đặc biệt là kim loại nặng vì gây tủa và vô hoạt enzyme, Natribenzoat: chất bảo quản. Thiết bị sử dụng: máy điều nhiệt, máy ly tâm, máy quang phổ kế, máy nghiền đồng hoá, máy đo pH.

Phương pháp thu nhận:

có 2 cách •Cách 1: Dạ dày xay nhuyễn, HCl 0.2%, bổ sung 0.7% acid boric trên tổng V  tỷ lệ 1:3 theo V. •Cách 2: Dạ dày xay nhuyễn, nước muối 10% Chỉnh HCl pH = 4  tỷ lệ 1:3 theo thể tích. Cho 0.7% acid boric trên tổng V [tác dụng bảo quản]. Giữ ở 35 – 400C cả 2 mẫu qua 30 giờ trong tủ ấm. Sau đó dùng HCl chỉnh pH = 4. Lấy ra đem lọc qua vải màn và vải nhiều lớp được dịch trích rennin thô có chứa rennin. Dịch rennin được kết tủa bằng cách acid hoá dung dịch hoặc bão hòa với NaCl. Gelatin thường xuyên được thêm vào để giúp kết tủa vá tách renin ra khỏi dung dịch bằng sự ly tâm 45 phút ở 5.000 vòng/ phút. •Thu rennin dạng bột Tiến hành tủa enzyme theo phương pháp diêm tích với muối trung tính bằng cách cho từ từ vào dung dịch thô một lượng NaCl khoảng 22 – 23% cho đến khi bão hoà NaCl. Để tủ lạnh 20 phút Lấy ra ly tâm lọc. Cạo lấy tủa để lên đĩa petri, sấy khô rồi để vào bình hút ẩm. Phương pháp thẩm tích bằng túi colodion. Màng bán thấm dializ dùng để tách muối và chỉ cho chất có phân tử lượng nhỏ thẩm tích qua túi mà giữ lại những chất có phân tử lượng lớn. Cân chính xác một lượng enzyme bột vào túi colodion [cellophane]. Cân trọng lượng túi có chứa enzyme, cho túi vào becher đựng nước cất và cho thẩm tích trong môi trường nứơc lạnh 0 – 40C. Khuấy và thay đổi nước lạnh thường xuyên [hai ngày đêm] làm khô nhanh túi bằng cách sấy quạt gió, nhiệt độ 30 - 400C. Cân trọng lượng túi sau khi sấy khô. •Hiệu số trọng lượng túi ban đầu và sau khi thẩm tích là lượng NaCl: m= m1 – m2 m1: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm trước thẩm tích [g] m2: Trọng lượng túi + mẫu thí nghiệm sau thẩm tích [g] m: Trọng lượng muối NaCl đã thẩm tích qua màng [g] Tinh sạch rennin: Rennin được chiết và làm sạch bằng sắc ký DEAE- Sephadex.

Tái chế: tách enzyme từ nước sữa [dung dịch còn lại sau khi tách phần đông tụ] và tái sử dụng bằng phương pháp sắc ký.

II.2.2.4.Enzyme Pacreatin [+] SpoilerPancreatin có ở trong tụy của động vật máu nóng và thường trích pancreatin tuỵ tạng của heo.
 Thành phần Pancreatin là hệ enzyme thuỷ phân xúc tác các phản ứng chuyển hoá đạm, đường, chất béo và một số chất khác ở trong ruột.

 Tính chất Pancreatin

 Thu nhận pancreatin

•Thu nhận pancreatin thô bằng phương pháp sấy: lấy tuỵ tươi đã được bảo quản, cân trong lượng và trộn với tinh bột một lượng bằng 10% so với trọng lượng tuỵ tươi.

Sau đó đem sấy ở những nhiệt độ 500C, 600C, 700C. Sau một thời gian sấy thì đem xay nhuyễn và được chế phẩm pacreatin thô.

II.2.2.5.Enzyme Trypsin [+] SpoilerTrypsin có trong dịch tuỵ người và động vật. Trong cơ thể sinh vật, trypsin hoạt động trong môi trường kiềm ở ruột nên gọi là protease kiềm tính. Vai trò của trypsin là tiếp tục thuỷ phân các protein thức ăn còn lại sau khi đã bị thuỷ phân một phần ở dạ dày. Ở trong máu cũng có một ít trypsin hoạt động. Sự hoạt hoá trypsinogen: Trong tuyến tuỵ, đầu tiên trypsin được tiết ra ở dạng không hoạt động là trypsinogen. Sau đó được hoạt hoá dưới tác động của enzim đường ruột enterokinase. pH tối ưu của trypsin là pH = 8. Nhiệt độ thích hợp là nhiệt độ cơ thể.

Hoạt động và tính đặc hiệu: Trypsin tác dụng lên hầu hết các cơ chất là protein, tác dụng trên hemoglobin, albumin biến tính của huyết tương, đối với collagen hay albumin của trứng thì cần xử lý nhiệt sơ bộ thì trypsin mới có tác dụng. Trypsin không làm đông tụ sữa như pepsin, rennin, chymotrypsin.

II.2.2.6.Enzyme Chymotrypsin [+] SpoilerChymotrypsin là một protease được tiết ra từ tuyến tuỵ. Là protease quan trọng sau trypsin. Chymotrypsin được thu nhận ở dạng tinh thể. Chymotrypsin tiết ra dưói dạng không hoạt động là chymotrypsinogen, sau đó chymotrypsinogen được chuyển sang dạng hoạt động là Chymotrypsin nhờ tác dụng của trypsin. Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường pH kiềm, hoạt động ở p H 7 - 8 và tối ưu là pH = 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5.4. Trong ruột, chymotrypsin thuỷ phân protein và các sản phẩm đã được tiêu hoá một phần bởi pepsin để tạo ra các peptide ngắn và các amino acid tự do. Hoạt tính của chymotrypsin tương đối hơi yếu hơn trypsin nhưng nó lại có khả năng thủy phân protein sâu sắc hơn.

 Phương pháp thu nhận tách chymotrypsin ra khỏi trypsin

 Chuẩn bị Đệm phosphate 0.067M, pH 7.0. Hòa tan 4.54g K2HPO4 trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa tan 4.73g NaH2PO4 khan vào trong nước thành dung dịch 500ml. Hòa chung 38.9ml dung dịch K2HPO4 với 61.1ml dung dịch NaH2PO4. Điều chỉnh pH bằng cách nhỏ từng giọt [nếu cần thiết] dung dịch NaH2PO4 đến khi đạt pH 7.0. Dung dịch cơ chất: Hòa tan 23.7mg N-acetyl-D-tyrosin ethyl ester [cơ chất thích hợp dùng để xác định chymotrypsin] vào khoảng 50ml dung dịch đệm phosphate 0.067M, pH 7.0. Giữ lạnh khi pha loãng với đệm pH 7.0 đến 100ml. Dung dịch trypsin tinh khiết: hòa tan một lượng chính xác trypsin tinh thể vào hydrochloric acid 0.001N để thu được một dung dịch chứa 650 đơn vị USP trypsin trong mỗi ml.  Cách thực hiện Độ hấp thu được đo bằng quang phổ kế trong điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh không được thay đổi quá 0.50C và nhiệt độ trong ngăn để mẫu là 25± 0.10C. Hút 200µl dung dịch acid HCl 0.001N và 3ml dung dịch cơ chất vào trong một cuvette 1cm. Đặt cuvette này vào quang phổ kế và điều chỉnh thiết bị để có được độ hấp thu 0.2 ở bước sóng 273nm. Hút 200µl dung dịch trypsin tinh khiết vào một cuvette khác, thêm 3ml dung dịch cơ chất và đặt cuvette vào quang phổ kế. Bắt đầu tính thời gian từ khi bắt đầu thêm dung dịch cơ chất vào dung dịch enzym. Đọc độ hấp thu sau khoảng 30 giây không kém hơn 5mm kể từ khi cho cơ chất vào dung dịch enzym. Lập lại các bước trên ít nhất một lần. Các giá trị của độ hấp thu tuyệt đối ít quan trọng hơn sự ổn định trong ít nhất 3 phút thì phải lập lại tiến trình trên và nếu cần thiết thì thực hiện với một nồng độ thấp hơn. Lập lại quá trình trên lần thứ hai với cùng nồng độ pha loãng, theo dõi sự thay đổi độ hấp thu trong lần thực hiện đầu tiên. Xác định sự thay đổi độ hấp thu trung bình trong mỗi phút, chỉ sử dụng các giá trị trong vòng 3 phút. Cách tính số đơn vị USP chymotrypsin mỗi mg trysin tinh khiết theo công thức: [A2 – A1] x [0.0075 TW] Với A2: Độ hấp thu lần đầu A1: Độ hấp thu lần cuối T : Thời gian giữa lần đầu đọc và cuối [phút]

W : Trọng lượng [mg] của trypsin tinh thể trong thể tích dung dịch được dùng xác định độ hấp thu.

Aug 06, 2011#102011-08-06T05:50

II.2.3. phương pháp thu nhân enzyme từ vi sinh vật
II.2.3.1.Thu nhận enzym protease [+] Spoiler Nguồn thu nhận enzym protease Nhiều VSV cố khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã được sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong quy mô công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học. Một số VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease: Vi khuẩn: Bac.subtilispha, Bac.cireulans, Bac.sphaericus, Bac.brevis, Bac.cerus… Xạ khuẩn: Str.griseus, Str.rimous, Str.fradiae,… Nấm mốc: Asp.oryzae, Asp.satoi, Asp.niegr, Pen.chrysogenum, Pen.cyaneo fulvum, Mucor.pusillus

 Các phương pháp thu nhận enzym protease

 Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt Là phương pháp kinh tế nên được sử dụng rộng rãi. Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5,6-6,2[ đối với nấm sợi] hoặc từ 6,2-7,2 [ đối với vi khuẩn]. Cho môi trường vào những khay lớn để nuôi cấy. Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó với mỗi VSV cần lựa chọn thời gian thích hợp nhất [ thời gian mà luợng enzym trong môi trường là lớn nhất]. Nói chung, đối với đa số nấm sợi mesofil có thể nuôi từ 32-42 giờ. Sau đó dùng nước hoặc dung dịch nuôi để chiết rút enzym khỏi môi trường, loại bỏ nhũng phần không hòa tan, kết tủa enzym bằng muối vô cơ hay dung môi hữu cơ.

 Nuôi cấy bằng phương pháp bề sâu

Chuẩn bị môi truờng thích hợp ngay trong thùng lên men và khử trùng. Sau khi làm lạnh, cấy VSV vào với tỷ lệ 1-10%. Sau một thời gian nuôi cấy, tiến hành kiểm tra hoạt độ enzym của dịch môi trong trường cấy. Khi hoạt động đã đạt đến cực đại cần nhanh chóng tách enzym ra khỏi tế bào VSV bằng cách ly tâm hay lọc. Khi dùng phương pháp bề sâu, muốn có kết quả tốt cần xác định cho được lượng oxy cần thiết trong thời gian sinh trưởng mỗi loài VSV. Thể tích thùng lên men càng lớn càng khó khống chế yếu tố này. Ở Nhật thường dùng các thùng lên men 20-30m3.Theo các tác giả Nhật nên cấy vào các thùng lên men[chứ không qua giai đoạn nuôi cấy trung gian] sẽ bảo đảm môi trường khỏi bị nhiễm.

 Thu nhận enzym protease

Tách enzym: Như trên đã nói, để tách enzym từ môi trường nuôi cấy theo VSV theo phương pháp bề mặt, có thể dùng dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối loãng hoặc nước để chiết rút enzym. Cho canh trường sau khi nuôi cấy vào dung dịch đã nói trên theo một tỷ lệ thích hợp, khuấy lắc đều trên máy lắc trong một thời gian xác định, lọc hoặc li tâm, thu lấy dung dịch trong. Trong sản xuất thường dùng máy để chiết rút enzym trong một giờ. Tiến hành theo phương pháp này cho kết quả rất tốt. Trong trường hợp nuôi cấy theo phương pháp bề sâu, trước hết cần làm lắng tế bào VSV hoặc ly tâm để tách sinh khối khỏi dung dịch enzym. Quá trình này là một giai đoạn quan trọng nhất và khó khăn nhất trong kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym.

Ở Nhật bản đã tìm đựơc phương hướng thích hợp để làm trong nước chiết và dịch môi trường nuôi cấy. Theo các tác giản Nhật thì nên lọc chứ không nên ly tâm vì khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt động enzym.

II.2.3.2.Thu nhận enzym amylase [+] SpoilerHệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811-1814. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, vi khuẩn, nấm men và vi khuẩn.

 Nguồn enzyme amylase

Trong thiên nhiên enzyme có nhiều ở hầu hết ở thực vật, động vật và vi sinh vật. Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tượng có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định. Ngày nay, do có ưu thế về nhiều mặt, VSV đã trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo. Người ta biết nhiều loại VSV có thể năng tổng hợp các enzyme amylase. Những chủng VSV tạo nhiều amylase thương được phân lập từ nguồn tự nhiên, bởi vì các loài khác và thậm chí các chủng VSV khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều hệ enzyme khác nhau. VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giá nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.

 Thu nhận enzyme amylase

Muốn thu được các enzyme amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để cấy truyền lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hóa các điều kiện nuôi. Như vậy là sự tổng hợp enzyme amylase không những chỉ phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu. Ngoài các yếu tố hóa học [thành phần môi trường] ra, cá điều kiện lý hóa của quá trình nuôi cũng có một ý nghĩa rất lớn đối với sinh tổng hợp các enzyme amylase. Người ta đã chứng minh rằng có thể dùng điều kiện nuôi khác nhau ở quy mô công nghiệp. Ví dụ, có thể dùng Bac.sublilis để thu chủ yếu là phức hệ amylase hoặc chủ yếu là phức hệ protease. Trong số những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp các enzyme amylase trong quá trình nuôi VSV, thì thành phần môi trường tính chất cơ lý của môi trường, độ tiệt trùng, độ ẩm ban đầu, độ thoáng khí, nhiệt độ nuôi và pH môi trường… là những yếu tố cơ bản tối quan trọng. Có hai phương pháp nuôi VSV là phương pháp bề mặt và phương pháp bề sâu.

 Nuôi VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt

Hầu hết VSV tạo amylase đều hấp thu carbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ [tinh bột, dextrin], hydro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. Cấu tử chính của môi trường VSV tạo amylase bằng phương pháp bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi VSV không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Chất lượng của cám mì, cám gạo có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của các emzyme amylase. Yêu cầu: hàm lượng tinh bột trong cám >= 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0.05%, nên dùng cám tốt, cám mới không có dư vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc. Có thể thay thể cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Các cấu tử được đưa vào có thể là chất làm xốp môi trường mà cám không có đủ. Các cấu tử này thường là mầm mạch [15-20%] , trấu[ 2-25%] mùn cưa [5-10%], có thể dùng cặn bỏ môi trường rắn [sau khi tách lyenzyme] làm cấu tử chính của môi trường. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử VSV khác nên cần phải thanh trùng để đảm bảo nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa VSV ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1-1.5atm trong vòng 4-6h, có thể thanh trùng loãng hơn nóng ở nhiệt độ 1200 C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin [40%] và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lương. Độ ẩm tối thích của môi trường: độ ẩm ban đầu 58-60%, và giữ độ ẩm này trong suốt quá trình nuôi. Độ ẩm tăng quá 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 55-50% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV cũng như tạo enzyme amylase. Trong quá trình sinh trưởng của mình VSV tiêu thụ 25-35% chất dinh dưỡng của môi trường và thải ra một lượng lớn nhiệt sinh lý và CO2. Vì vậy cần phải thải nhiệt này bằng cách thông gió với không khí vô trùng có độ ẩm tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tiếp, gián đoạn [hoặc không khí tự nhiên] tùy thuộc vào chiều dày của lớp môi trường nuôi, vào khoảng cách giữa các tầng khay và dây khay thường là giai đoạn sinh truởng thứ nhất phải thông khí vào phòng nuôi khoảng 4-5 lần thể tích không khí trên một thể tích phòng trong một giờ, còn giai đoạn thứ hai là 30-60 thể tích không khí trên thể tích phòng nuôi/1 giờ, còn giai đoạn thứ ba giảm đi còn 10-12 thể tích không khí. Nhiệt độ nuôi: toàn bộ chu kỳ sinh trưởng của nấm mốc trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ: + Thời kỳ trương và nảy mầm của đính bào tử [đối với nấm mốc 10-11 giờ đầu tiên], đối với vi khuẩn 3-4 giờ thời kỳ này phải đốt nóng không khí phòng nuôi và giữ cho nhiệt độ phòng nuôi không thấp hơn 23-300C đối với nấm mốc và duy trì nhiệt độ 32-380C cho vi khuẩn. Độ ẩm tương đối của không khí 96-100% + Thời kỳ sinh trưởng nhanh của hệ sợi [kéo dài trong vòng 4-18 giờ]. Thời kỳ này cần hạ nhiệt độ phòng giúp sợi nấm mọc đều và đẹp. Ở nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-290C và độ ẩm cao vào phòng nuôi. Để tăng cường khả năng sinh trưởng của VSV và khả năng tạo enzyme có thể thêm nước chiết mầm mạch, nước chiết ngô, nước cám nấu, nước chiết bột đậu nành. Một trong các điều kiện quan trọng có ảnh hưởng lớn tới sinh tổng hợp các enzyme amylase ở các chủng VSV nuôi chìm là nồng độ ion hydro trong môi trường và sự biến đổi của nó trong quá trình sinh trưởng của chủng nuôi. Độ acid của canh trường được xác định bởi thành phần và tính chất của các muối vô cơ thêm vào môi trường cũng như sự tiêu thụ các muối này bởi VSV. Trước hết, pH của canh trường phụ thuộc vào tính chất của nguồn nitơ vô cơ. Nếu như thêm vào môi trường các muối ammonium, thì khi VSV tiêu thụ ion ammonium, các anion được giải phóng ra sẽ acid hóa môi trường. Vì thế cần phải cho thêm CaCO3 vào để trung hòa môi trường hoặc duy trì tự động giá trị pH thích hợp cho việc tổng hợp các enzyme amylase. Khi nguồn nitơ vô cơ được dùng là các muối nitrate, thì trong quá trình VSV tiêu thụ anion [NO3] sẽ giải phóng ra các ion kim loại và môi trường bị kiềm hóa pH tăng lên. pH ban đầu của môi trường để nuôi Asp.oryzae nhằm thu -amylase là 5.5 - 5.7 [môi trường sapeck cải tiến có 6% tinh bột, nước chiết mầm mạch và NaNO3]. Trong quá trình nuôi môi trường bị kiềm hóa dần dần và tới cuối ký sinh trưởng canh trưởng có pH = 7.8 - 8.2. Trong trường hợp này, sự kiềm hóa tự nhiên môi trường khi VSV sử dụng NaNO3 làm nguồn nitơ vô cơ có ảnh hưởng tốt tới sinh tổng hợp -amylase [là pH = 7-8] khác hẳn giá trị pH tối thích đối với hoạt động của enzyme [pH = 4,7- 4,9]. Khi điều chỉnh pH tới giá trị ban đầu hoặc chỉ acid hóa một chút thôi [pH=6] thì họat lực -amylase cũng giảm đi nhiều [gần bằng 23%]. Khi dùng các muối ammonium phosphate làm nguồn nitơ để nuôi chủng mốc này thì pH tối thích của môi trường phải nằm trong vùng 6-7. Để thu glucoamylase người ta nuôi Asp.awamori trong môi trường Sapeck có 6% tinh bột. Glucoamylase tích lũy cực đại trong canh trường ở ngày thứ 3 tại pH = 8. pH tối thích ban đầu cho chủng này sinh trường là 7,0 -7,2. Khi kết thúc pH canh trường là 7,6-8,0 [Fenikxova. Silova,1960]. pH môi trường để nuôi vi khuẩn Bac. Subtilis nhằm thu hút -amylase thích hợp nhất là 6,3-7,9. Nên pH ban đầu cao hơn 7,5 hay thấp hơn 7,0 đều giảm vận tốc sinh tổng hợp enzyme, còn nếu pH bằng 8,8 - 9,0 thì vi khuẩn hầu như không phát triển. Nhiệt độ nuôi cũng là một yếu tố quan trọng đối với sinh truởng của VSV và sự tạo thành các enzyme amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ nhiệt độ sẽ dẫn đến làm giảm hoạt lục các enzyme amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30-320C [trong đó có Asp.oryzae và Asp.awarmoni]. Đối với -amylase, môi trường thích hợp nhất và tạo nhiều amylase ở nhiệt độ 370C. Một số vi khuẩn khác lại có nhiệt độ sinh trưởng tối thích cao hơn. Bac.diataticus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 65-700C song lại tạo nhiều amylase hoạt động ở 500C vì vậy người ta thường cấy giống ở nhiệt độ 700C còn tiến hành cho tích lũy amylase ở 500C nuôi chủng loại này bằng môi trường lỏng có nước nấu khoai tây, pepton và phấn. Nhiệt độ nuôi có ảnh hưởng rất lớn tới độ bền nhiệt của enzyme tạo thành amylase của Bac.coagulans và Bac.slerothermophilus đuợc nuôi ở 350C và 550C có độ bền nhiệt khác xa nhau. Khi giữ ở 900C trong 1 giờ thì amylase của chủng sinh trưởng ở nhiệt độ 350C bị mất 90-94% hoạt độ ban đầu, trong lúc đó amylase của chủng được nuôi ở nhiệt độ 550C chỉ bị vô hoạt có 10-12% [Campell,1955]. Các VSV ưa nhiệt [vi khuẩn] sinh tổng hợp nên các amylase bền nhiệt. Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn trong nhiều lĩnh vực sản xuất. Ngoài ra nuôi vi khuẩn ưa nhiệt lại rất tiện lợi cho sản xuất công nghiệp. Vì nuôi ở nhiệt độ cao tạo ta điều kiện chọn lọc và cho phép giảm bớt yêu cầu khắt khe về độ tiệt trùng, đồng thời khi nuôi đỡ bị nhiễm. Sục khí và khuấy trộn: Phần lớn VSV tạo amylase là những VSV hiếu khí. Vì vậy sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào lượng oxy phân tử hòa tan trong dịch nuôi cấy. Trong quá trình sinh trưởng của mình, VSV sử dụng oxy phân tử cho hoạt động sống nên lượng oxy hòa tan trong môi trường lỏng phải luôn luôn được bổ sung. Chính vì lẽ đó, việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như sinh tổng hợp các enzyme của VSV. Việc khuấy đảo môi trường dinh dưỡng trong quá trình nuôi VSV có thể thực hiện bằng nhiều cách khác nhau: - Sục không khí vô trùng vào thiết bị nuôi - Bằng máy các kiểu chuyên dùng - Bằng tác dụng hiệp đồng của cả sục khí lẫn máy khuấy - Bằng tác dụng của cả khí sinh ra khi lên men. Nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng muốn nuôi VSV tạo enzyme [cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn] có hiệu suất cao thì phải khuấy đảo môi trường bằng sục khí hoặc bằng máy khuấy làm việc liên tục trong suốt quá trình nuôi. Việc chọn chế độ sục khí thích hợp sẽ có tác dụng khá quyết định không chỉ đối với sự sinh trưởng và phát triển của VSV hiếu khí trong điều kiện nuôi chìm mà còn đối với sự sinh tổng hợp enzyme amylase nữa. Đối với nấm sợi, chế độ sục khí thích hợp là 10-12m3 không khí vô trùng [có nhiệt độ cao không quá 400C] trên 1m3 môi trường trong 1 giờ với thời gian nuôi trong khoảng 68-72 giờ. Với thời gian nuôi ngắn hơn ở các thùng lên men nhân giống [48 giờ] thì lượng không khí cần sục vào môi trường để nuôi Asp.oryzae [3-9-15] phải là 30m3/m3 môi trường/ giờ đối với thùng nhân giống và 40m3/m3 môi trường/giờ cho thùng sản xuất. Mức độ sục khí tối ưu để nuôi Asp.oryzae tương ứng với 180 micromol O2/lít môi trường [nồng độ oxy hòa tan đo bằng máy cực phổ với điện cực kiểu clark]. Chủng này có vận tốc tiêu thụ oxy hòa tan cực lớn vào cuối pha sinh trưởng. Vận tốc tiêu thụ O2 giảm dần từ lúc bắt đầu pha ổn định. Nuôi VSV ưa nhiệt đòi hỏi nhiều không khí hơn là nuôi VSV ưa ẩm. Điều này cũng dễ hiểu thôi, bởi lẽ ở nhiệt độ tương đối cao [50-650C], độ hòa tan của oxy trong môi trưòng giảm xuống, mặc dù nhu cầu của VSV ưa nhiệt độ oxy cho các phản ứng oxy hóa có tăng lên. Nguời ta nuôi Bac.subtilis trong thùng nhân giống [15 giờ ở 370C] có cánh khuấy làm việc liên tục và sục không khí vô trùng vào môi trường với lượng là 40m3/m3 môi trường/giờ. Còn nuôi vi khuẩn này trong thùng lên men sản xuất [trong 48 giờ ở 370C] có cánh khuấy liên tục và sục không khí vô trùng với lượng 60m3/m3 môi trường/giờ. Thời gian nuôi VSV để có lượng amylase cực lớn trong phưong pháp nuôi chìm phụ thuộc vào đặc tính sinh lý của chúng, vào phương pháp nuôi và một số yếu tố liên quan. Việc xác minh thời gian nuôi tối thích cũng đựoc tiến hành bằng thực nghiệm. Chẳng hạn ngưòi ta nuôi Asp.oryzae trong thùng lên men nhân giống 48 giờ, còn nuôi trong thùng lên men sản xuất thì khoảng 48-52 giờ. Lượng giống đem cấy vào thùng lên men là 8-10% so với tổng thể tích môi trưòng dinh dưỡng.

Trong công nghiệp rượu, khi nuôi nấm Aspergillus bằng phương pháp gián đoạn thì thời gian nuôi tối thích là 68-72 giờ. Tuổi của nấm tốt nhất là 24-30 giờ và lượng vật liệu gieo cấy là 10% so với tổng thể tích môi trường dinh dưỡng. Khi nuôi bằng phương pháp tuần hoàn liên tục và phương pháp dòng chảy liên tục, thời gian nuôi sẽ ngắn hơn rất nhiều [30-40 giờ] Asp.oryzae sản sinh glucoamylase cũng đựơc nuôi trong thùng nhân giống 48 giờ và nuôi trong thùng lên men sản xuất 52 giờ hay hơn nữa. Thời gian nuôi Bac.diastalicus [để thu chế sản phẩm superbiolase dùng trong công nghiệp bia và công nghiệp dệt] trong thùng nhân giống kéo dài 15 giờ, còn trong thùng sản xuất tới 48 giờ với lượng giống cho vào là 10% so với thể tích môi trường dinh dưỡng. Đối với Endomycopsis spp thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn phải tới 80 giờ.

II.2.3.3.Thu nhận enzym pectinase [+] SpoilerEnzym pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này vì vậy có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. •Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt Môi trường sử dụng để nuôi cấy VSV để thu nhận pectinase thường là cám gạo, hay cám mì, bã củ cải hoặc thóc mầm…Nguồn dinh dưỡng bổ sung thường là các muối ammonim, phosphoric… Độ ẩm môi trường phải nằm trong khoảng 60%. Nấm mốc A.awamori thường được nuôi cấy ở 300C trong thời gian 40h, sau đó giảm xuống 240C và nuôi trong 48-52h. Sản phẩm sau khi lên men được sấy khô thành chế phẩm enzyme thô và đem tinh chế. Để thu được chế phẩm pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzyme thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate. Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzyme pectinase có thể là rượu ethanol [72,5-75%] hoặc isopropanol [55-57%]. Muối ammonium sulfate sử dụng có độ bão hòa 0.79. Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzyme thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, con nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75%. Nhiệt độ kết tủa tối ưu đối với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt. Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản.

Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu

Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của VSV gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hóa mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn. pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6 - 7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kiềm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích lũy enzyme pectinase.pH = 4 ức chế hoàn toàn sự tích lũy enzyme pectinase. Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5 - 5,0 tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm. Tuy nhiên, pH của các trường nuôi cấy A.niger và A.awamori có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự. Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24,32 và 48h tuổi với hàm lượng từ 2-10h. Đối với A. niger và A. awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi truờng dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử. Thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h. Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm từ 6% xuống còn 1,5-1,8%. Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180% và đi ra đạt 60-70%. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 400C. Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránh hút ẩm. Có thể thu chế sản phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzyme trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỷ lệ 4:1, với aceton theo tỷ lệ 2:1 và isopropanol theo tỷ lệ 1,3:1 hoặc với muối ammonium sulfate [50-80% trong muối kết]. Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-89% so với họat độ của dịch canh trường ban đầu. Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfate, cần tách muối ra khỏi enzyme bằng phương pháp thẩm tích [với nước hoặc dung dịch đệm], sau đó sấy khô. Khi độ bão hòa của [NH4]2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp [đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô], nhưng nếu kết tủa bằng [NH4]2¬SO4 có độ bão hòa 1,0 thì sẽ kết tủa được đoạn chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao. Môi trường: Bã củ cải: 2%; [NH4]2HPO4: 0,75%, KH2P04:0,1%; CaCO3: 0,3%; nước chiết ngô: 0,5%. Clostridium pectinofermentants có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng đồng thời với sự tích lũy sinh khối. Sự tích lũy enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h. pH ban đầu cuả môi trường dinh dưỡnglà 6,5-7,0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở dạng canh trường bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 350C. Cl. Felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi trường gồm có: Lactose:20%; pectin củ cải: 1%; [NH4]2HPO4: 0,4%; K2HPO4 : 0.3%; NaCl: 0,1%; MgSO4¬: 0.025 %; FeSO4: dạng viết; CaCO3: 0,5%; dịch nấm men tự phân: 0.05%; ascorbic acid: 0,5%. Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfate. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6,5-6,8. Nếu kết tủa bằng 2-2,5 thể tích aceton thì hoạt độ của enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu. Khi kết tủa bằng ammonium sulfate có độ bão hòa bằng 0,2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hòa là 0,9 - 1 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintranseliminase và exopolygalacturonase. •Phương pháp hiện đại trong chuẩn bị chế phẩm enzyme pectinase thường theo các bước cơ bản sau đây: - Khử muối bằng phương pháp lọc gel [Biogel P100] - Tách protein bằng phương pháp trao đổi anion [DEAE Bilogel A], hay trao đổi cation [CM Bilogel A] - Tách enzym pectinase bằng alginate liên kết ngang - Tinh sạch bằng FPLC

Aliginate liên kết ngang hoạt động bằng cách kết hợp ái lực, ảnh hưởng tĩnh điện và thay thế pectate liên kết ngang.

II.2.3.4.Thu nhận enzym cellulase [+] Spoiler VSV sinh tổng hợp cellulase Trong điều kiện tự nhiên, cellulase bị phân hủy vởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và yếm khí. Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulase đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Số lượng các loài VSV tham gia sinh tổng hợp các enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp còn thấy cả nấm men. Một số loài VSV được nghiên cứu: Altenaria tennuis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Penicillium Spp, Trichoderma reesei, Actinomycees spp…

 Phương pháp thu nhận enzyme cellulase

VSV có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc ba nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất sản xuất enzyme cellulase hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy sợi nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được ứng dụng trong sản xuất. Để thu nhận enzyme cellulase từ nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng môi trường xốp [còn gọi là môi trường bán rắn]. Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển rất tốt trong môi trường có độ ẩm là 60-65%, có cơ chất là cellulase. Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulase và phải có độ xốp nhất định để không khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào trong khối môi trường.Cả hai nhóm xạ khuẩn và nấm sợi đều là những VSV hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường xuyên phải được cung cấp oxy. Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát triển mạnh trong môi trường kiềm và môi trường acid yếu, còn nấm sợi phát triển ở môi trường acid. Do đó, khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ khuẩn từ 6,2-7,6, còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5-5,5. Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase củ xạ khuẩn và nấm sợi cũng khác nhau. Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 giờ đến 48 giờ đã cho hoạt tính enzyme cellulase rất cao. Trong khi đó, xạ khuẩn phải mất ít nhất là 72 giờ mới tổng hợp cellulase nhiều. Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của cả hai nhóm VSV này, các loài xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzyme cellulase của xạ khuẩn cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzyme cellulase của nấm sợi. Sau khi nuôi cấy trong những điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối VSV, thành phần môi trường và enzyme. Công việc tiếp theo là áp dụng các phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối VSV sẽ thu được enzyme dạng bán tinh khiết. Enzyme bán tinh khiết còn chứa nước, protein không hoạt động và enzyme. Bằng phương pháp hóa ký, ta sẽ loại được nước, protein không hoạt động. Khi đó ta thu được chế phẩm enzyme tinh khiết. Hiện nay, enzyme cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường. Chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền. trong kỹ thuật tạo tế bào trần [protoplast], người ta thường dùng chế phẩm enzyme cellulase tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật.

Ứng dụng enzyme cellulase phá vỡ tế bào thực vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn các nhân tố di truyền. Do đó, phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp cơ học và hóa học.

II.2.3.5.Thu nhận enzym lipase [+] Spoiler VSV tổng hợp lipase Trong thiên nhiên có nhiều loài VSV có khả năng sinh tổng hợp lipase. Chúng bao gồm cả nấm sợi, nấm men và vi khuẩn. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Asperrgillus spp, Muscor spp, Rhizopus spp, Penicillium spp, Geotrichum spp. Nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Trorulopsis spp, Candia spp. Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp, Achromobacter spp, Staphylococcus spp.

 Thu nhận enzyme lipase

Trong công nghiệp, người ta thường sản xuất lipase chủ yếu bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt. Trong môi trường có bổ sung chất béo như một cơ chất cảm ứng. Tuy nhiên, hàm lượng chất béo cho vào môi trường với số lượng rất nhỏ [khoảng Chế phẩm thô thu nhận được sẽ được xử lý để tách enzyme khỏi môi trường nuôi cấy và tiến hành loại các tạp chất, cuối cùng là làm kết tủa, tinh chế và thu nhận enzyme tinh khiết. Enzyme lipase được ứng dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa, trong sản xuất phomai.

Tinh sạch enzyme amylase bằng phương pháp sắc ký

Video liên quan

Bài Viết Liên Quan

Top 15 quần áo pijama nữ lụa lửng tốt nhất 2022

Lãi suất vay tín chấp ngân hàng vietcombank mới nhất năm 2022

Phép cộng có nhớ trong phạm vi 1000 sách Kết nối

Từ sắt và các hoá chất cần thiết hãy viết các phương trình hoá học để thu được các oxit riêng biệt

Top 4 bulldog skincare tốt nhất 2022

Công thức các cấp so sánh

Ý nghĩa của việc nhuộm bằng phương pháp gram đối với các chủng vi khuẩn Sinh 10

Lý thuyết và bài tập liên kết hóa học violet

Công thức liên hệ giữa khối lượng và trọng lượng của một vật

Top 9 nhẫn vàng đính pha lê nhân tạo tốt nhất 2022

Những câu nói hay về tình yêu trong văn học

Top 14 thuốc giải độc gan tốt nhất hiện nay tốt nhất 2022

Các trường đại học cố ngành Triết

Top 4 kệ để đồ trang điểm lớn tốt nhất 2022

Tìm m để phương trình có 2 nghiệm nguyên dương

Chính sách giá của Chính phủ thực tế ở Việt Nam hiện nay

Tại sao luôn là tôi tiếng anh

Đại học Khoa học Tự nhiên Thủ Đức

Đề hóa lớp 8 học kì 1

Top 1 pôkemon tốt nhất 2022

Toplist mới

Top 7 sự tích hồ gươm - ngữ văn lớp 6 2023

Top 7 gdcd 6 bài 1 kết nối tri thức 2023

Top 7 ý nghĩa của xây dựng gia đình văn hóa 2023

Top 6 mẫu hợp đồng mượn đất làm nhà xưởng 2023

Top 3 tổng tài biến thái tôi yêu anh tập 27 2023

Top 6 kết thực phim mỹ nhân vô lệ 2023

Top 9 trong những câu thơ sau câu nào sử dụng thành ngữ 2023

Top 8 đề tài và chủ de của tác phẩm tắt đèn 2023

Top 5 tiểu sử của thầy thích pháp hòa 2023

Bài mới nhất

B.n.n bị tố đạo văn 80 năm 2024

Làm thế nào để hết chuột rút bắp chân năm 2024

Bán đất đường trần quang diệu thành phố thanh hóa năm 2024

Ngành tâm lý học nên học trường nào năm 2024

Công thức giải nhanh hóa vô cơ 12 năm 2024

Chủ Đề