Có nhiều phương pháp phân tích protein trong ngành công nghệ sinh học hay hóa học. Mỗi phượng pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Các phương pháp đó gồm phương pháp Dumas, phương pháp sử dụng quang phổ, phương pháp Lowry…
Tuy nhiên có 1 phương pháp thường được sử dụng nhất là phương pháp Kjeldahl. Nhưng trước tiên các bạn cần hiểu protein và cơ chế hoạt động của nó trước nha.
Protein là gì?
Protein là các polyme axit amin. Hai loại axit amin khác nhau xuất hiện tự nhiên trong protein. Protein khác nhau theo loại, số lượng và trình tự của các axit amin tạo nên xương sống polypeptide. Kết quả là chúng có cấu trúc phân tử khác nhau, các thuộc tính dinh dưỡng và các đặc tính lý hóa.
Protein là thành phần quan trọng của thực phẩm vì một số lý do khác nhau. Chúng là nguồn năng lượng chính, cũng như chứa các axit amin thiết yếu, như lysine, tryptophan, methionine, leucine, isoleucine và valine, rất cần thiết cho sức khoẻ con người, nhưng cơ thể không thể tổng hợp được.
Protein cũng là thành phần cấu trúc chính của nhiều loại thực phẩm tự nhiên, thường xác định kết cấu tổng thể của chúng, ví dụ: thịt hoặc cá.
Cấu trúc phân tử Protein
Protein cô lập thường được sử dụng trong thực phẩm làm nguyên liệu vì các đặc tính chức năng độc đáo của chúng, nghĩa là khả năng cung cấp sự xuất hiện, kết cấu hoặc độ ổn định mong muốn của chúng. Thông thường, các protein được sử dụng làm chất tạo gel, chất nhũ hoá, chất tạo bọt và chất làm đặc.
Nhiều loại protein thực phẩm là các enzyme có khả năng tăng cường tỷ lệ các phản ứng sinh hóa nhất định. Những phản ứng này có thể có tác động thuận lợi hoặc bất lợi đối với tính chất tổng thể của thực phẩm.
Các nhà phân tích thực phẩm quan tâm đến việc biết tổng nồng độ, loại, cấu trúc phân tử và tính chất chức năng của các protein trong thực phẩm.
Xem thêm >>> Máy chưng cất đạm kjeldahl UDK 139 giúp xác đinh hàm lượng protein chính xác nhất.
Khái niệm phương pháp Kjeldahl
Phương pháp Kjeldahl được phát triển vào năm 1883 bởi một nhà sản xuất bia tên là Johann Kjeldahl. Một thực phẩm được tiêu hóa với một axit mạnh để nó giải phóng nitơ có thể được xác định bằng một kỹ thuật chuẩn độ thích hợp.
Lượng protein hiện diện sau đó được tính từ nồng độ nitơ của thực phẩm. Cách tiếp cận cơ bản tương tự vẫn được sử dụng ngày nay, mặc dù một số cải tiến đã được thực hiện để tăng tốc quá trình và để có được các phép đo chính xác hơn.
Nó thường được coi là các phương pháp tiêu chuẩn để xác định hàm lượng protein. Bởi vì phương pháp Kjeldahl không đo hàm lượng protein trực tiếp yếu tố chuyển đổi [F] là cần thiết để chuyển đổi nồng độ nitơ đã đo thành nồng độ protein.
Một hệ số chuyển đổi 6,25 [tương đương 0,16 g nitơ mỗi gram protein] được sử dụng cho nhiều ứng dụng, tuy nhiên, đây chỉ là giá trị trung bình, và mỗi protein có một yếu tố chuyển đổi khác nhau tùy thuộc vào thành phần axit amin của nó. Phương pháp Kjeldahl có thể được chia thành ba bước:Nguyên lý, trung hoà và chuẩn độ.
Những nguyên tắc chính trong phương pháp Kjeldahl
1. Nguyên lý
Mẫu vật sau khi phân tích sẽ cho vào bình phân hủy và sau đó được hấp thụ bằng cách nung nóng axit sulfuric [chất oxy hóa tiêu hóa thức ăn], natri sulfat khan [để tăng tốc độ phản ứng bằng cách tăng điểm sôi] và một chất xúc tác, chẳng hạn như đồng, selen, titan, hoặc thủy ngân [để tăng tốc độ phản ứng].
Nguyên lý chuyển đổi bất kỳ nitơ trong thực phẩm [khác với trong đó là ở dạng nitrat hoặc nitrit] thành amoniac, và các chất hữu cơ khác để C02 và H20.
Khí amoniac không được giải phóng trong dung dịch axit vì amoniac có trong dạng ion amoni [NH4+ ] liên kết với ion sunfat [SO4 2- ] và do đó vẫn còn trong dung dịch
N [thực phẩm] -> [NH4]2 SO4 [1]
2. Trung hòa
Sau khi hoàn thành quá trình phân hủy, bình phân hủy được nối với bình nhận bằng ống. Dung dịch trong bình phân hủy sau đó được tạo ra bằng cách thêm natri hydroxit, chuyển đổi amoni sulfat thành khí amoniac theo phương trình hóa học sau:
[NH 4 ]2 SO4 + 2NaOH -> 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 [2]
Khí amoniac được tạo thành được giải phóng khỏi dung dịch và di chuyển ra khỏi bình phân hủy và vào bình nhận chứa quá nhiều axit boric. Độ ph thấp của dung dịch trong bình nhận chuyển đổi khí amoniac thành ion amonia, đồng thời chuyển đổi axit boric thành ion borat:
NH3 + H3BO3 [axit boric] -> NH4 + + H2BO 3 – [ion borat] [3]
3 Chuẩn độ
Hàm lượng nitơ sau đó được ước tính bằng cách chuẩn độ của borat amoni được hình thành với axit sulfuric hoặc hydrochloric tiêu chuẩn, sử dụng một chỉ số phù hợp để xác định điểm cuối của phản ứng
H2BO3– + H+ -> H3BO3 [4]
Nồng độ của các ion hydro [trong mol] cần thiết để đạt đến điểm cuối tương đương với nồng độ nitơ trong thực phẩm gốc [phương trình 3].
Ưu và nhược điểm phương pháp Kjeldahl
Ưu điểm. Phương pháp Kjeldahl được sử dụng rộng rãi trên phạm vi quốc tế và vẫn là phương pháp chuẩn để so sánh với tất cả các phương pháp khác. Tính tổng quát, độ chính xác cao và khả năng tái lập tốt của nó đã làm cho nó trở thành phương pháp chính để ước lượng protein trong thực phẩm
Nhược điểm. Nó không đưa ra một thước đo của protein thực sự, vì tất cả nitơ trong thực phẩm không ở dạng protein. Các protein khác nhau cần các yếu tố hiệu chỉnh khác nhau vì chúng có các trình tự axit amin khác nhau.
Việc sử dụng axít sulfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao gây ra một mối nguy hiểm đáng kể, cũng như việc sử dụng một số chất xúc tác có thể có kỹ thuật tốn thời gian để thực hiện..
Hiện nay có nhiều cách để chúng ta có thể xác định nồng độ Nitơ trong nước thải. Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng, nên không thể nói phương pháp nào là tốt nhất. Cùng Biogency điểm qua ba cách được áp dụng nhiều nhất hiện nay.
Trong nước thải, Nitơ thường tồn tại 2 nhóm: Nitơ vô cơ và và Nitơ hữu cơ. Nitơ vô cơ thì đơn giản, đa số là Amoni, Nitrat và Nitrit hoặc Ure. Nitơ hữu cơ thì phức tạp hơn, nó có thể là các Amin bậc thấp, Axit Amin, Protein…
Hình 1. Các dạng tồn tại của Nitơ trong nước.
Có ba cách thường dùng để xác định nồng độ Nitơ trong nước thải là:
- Phương pháp Test nhanh so màu với bộ test WIT-TN-i.
- Phương pháp phân tích Nitơ bằng Máy đo quang HI83314.
- Phương pháp phân tích hàm lượng Nitơ bằng Kjeldahl.
Mỗi phương pháp được sử dụng như thế nào? Ưu và nhược điểm của nó là gì? Tất cả sẽ được giải đáp qua bài viết dưới đây.
1. Xác định nồng độ Nitơ bằng phương pháp Test nhanh so màu với bộ test WIT-TN-i
Bộ test Nitơ tổng WIT-TN-i gồm:
- 1 chai thuốc thử WIT-TN-I-RA.
- 1 gói thuốc thử [50 tủi nhỏ] WIT-TN-I-RB.
- 1 gói thuốc thử [50 tủi nhỏ] WIT-TN-I-RC.
- 1 Cuvet nhựa.
- 2 pipet nhựa.
- 1 thang màu chuẩn.
Hình 2. Cách xác định Nitơ tổng trong nước thải với bộ kit test Nitơ WIT-TN-I.
Lưu ý: Trong trường hợp màu Cuvet mẫu nằm giữa 2 thang màu thì đọc giá trị xấp xỉ.
Với bộ Test nhanh Nitơ tổng này được đóng gói nhỏ gọn, thao tác đơn giản để kiểm tra Nitơ trong nước thải trong khoảng đo 0 – 100 ppm. Phương pháp được thực hiện nhanh chóng và có thể thực hiện trong hoặc ngoài phòng lab. Tuy nhiên, đây là phương pháp so màu, chính vì vậy có thể bị sai số trong quá trình đo.
2. Xác định nồng độ Nitơ bằng Máy đo quang HI83314
Dụng cụ và thuốc thử bao gồm:
- Thuốc thử HI 93767B-50.
- Ống HI93767B-B.
- Chai DEIONIZED120.
- Gói PERSULFATE/N, gói BISULFITE/N, gói HI93767 0.
- Ống HI93766V 0HR.
Phương pháp này đòi hỏi phải hiệu chỉnh ống trắng. Một ống trắng có thể dùng nhiều lần. Để ống trắng ổn định 1 tuần nếu bảo quản ở nơi tối ở nhiệt độ phòng. Luôn dùng thuốc thử giống nhau cho ống trắng và mẫu. Để có độ chính xác cao, mỗi phương pháp đo dùng một ống trắng riêng biệt.
Phương pháp yêu cầu phải làm nóng mẫu bằng thuốc thử xử lý trong vòng 30 phút ở nhiệt độ 105 độ C, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng trước khi phân tích.
Hình 3. Máy đo quang HI83314.
Hình 4. Máy phá mẫu HI839800.
Phương pháp xác định nồng độ Nitơ này mang lại kết quả tương đối chính xác hơn so với phương pháp test nhanh. Đồng thời, chúng ta có thể xác định được luôn các chỉ tiêu khác như Amonia, Nitrit và Nitrat. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị và các bước tiến hành phức tạp hơn là phương pháp test nhanh và khó có thể thực hiện được tại hiện trường khi không có nguồn điện.
3. Xác định nồng độ Nitơ bằng Phương pháp Kjeldahl
Đây là phương pháp giúp xác định hàm lượng Nitơ trong các hợp chất hữu cơ và vô cơ. Phương pháp phân tích Nitơ của Kjeldahl là tiêu chuẩn trên toàn thế giới để tính toán hàm lượng Protein trong nhiều loại vật liệu khác nhau, từ thức ăn của người và động vật, phân bón, nước thải và hóa thạch.
Phương pháp Kjeldahl được phát triển vào năm 1883 bởi một nhà sản xuất bia tên là Johann Kjeldahl. Một loại thực phẩm được tiêu hóa bằng một axit mạnh để nó giải phóng nitơ có thể được xác định bằng một kỹ thuật chuẩn độ phù hợp.
Đây là một phương pháp chính và được nhiều tổ chức công nhận như AOAC, USEPA, ISO, DIN, Pharmacopeias.
- Ưu điểm: Phương pháp Kjeldahl được sử dụng rộng rãi trên phạm vi quốc tế và vẫn là phương pháp tiêu chuẩn để so sánh với tất cả các phương pháp khác. Tính phổ biến, độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác
- Nhược điểm: Phương pháp này có sử dụng Axit Sunfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao gây ra một mối nguy hiểm đáng kể, cũng như việc sử dụng một số chất xúc tác có thể có. Kỹ thuật này rất tốn thời gian để thực hiện.
Hình 5. Phân tích hàm lượng Nitơ bằng phương pháp Kjeldahl.
Sử dụng phương pháp nào để xác định nồng độ Nitơ trong nước thải còn tùy thuộc vào từng yêu cầu cụ thể và điều kiện của doanh nghiệp. Nhưng chắc chắn một điều rằng, hàm lượng Nitơ trong nước thải cần phải xử lý đạt chuẩn trước khi thải ra môi trường. Để tìm hiểu thêm về các giải pháp sinh học xử lý Nitơ trong nước thải, hãy liên hệ ngay đến Biogency qua Hotline 0909 538 514 để được hỗ trợ nhanh nhất.
>>> Xem thêm: Chu trình Nitơ là gì? Quá trình diễn ra chu trình Nitơ