Thuật ngữ PCR là viết tắt của "Polymerase-Chain-Reaction", đây là một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Bài viết này nhằm giới thiệu các thông tin quan trọng về kỹ thuật PCR cũng như các vấn đề thường gặp khi sử dụng kỹ thuật này.
KỸ THUẬT PCR LÀ GÌ?
Thuật ngữ PCR chỉ một phản ứng nhân bản DNA dựa trên các chu kỳ nhiệt. Phản ứng diễn ra trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịch phản ứng [gọi là PCR mix]. Trong PCR mix sẽ chứa các thành phần:
- 1] Polymerase chịu nhiệt [Taq polymerase], enzyme này có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 72 oC.
- 2] 4 loại nucleotide [dNTP] gồm: dATP/dTTP/dGTP/dCTP là nguyên liệu để tổng hợp ra các bản sao DNA.
- 3] DNA chứa trình tự mục tiêu [Template]: Thông thường trong xét nghiệm thì đây là DNA thu nhận từ mẫu cần xét nghiệm.
- 4] Cặp mồi đặc hiệu [Primer]: Đây là các đoạn oligo-nucleotide dài khoảng 20 nucleotide và bắt cặp bổ sung đặc hiệu cho 2 đầu trình tự mục tiêu cần nhân bản.
- 5] Cation Mg2+ [MgCl2]: đây là co-factor quan trọng để Taq polymerase hoạt động hiệu quả.
- 6] Dung dịch đệm Tris-KCl [PCR Buffer]: Cung cấp môi trường thuận lợi cho phản ứng nhân bản diễn ra.
Ống nghiệm chứa PCR mix sẽ được đặt vào trong buồng ủ của máy luân nhiệt [Thermo cycler], ở Việt Nam thì thường gọi luôn là máy PCR. Nhiệt độ bên trong buồng ủ của máy PCR sẽ thay đổi theo chu kỳ, nhờ đó mà quá trình nhân bản DNA được diễn ra [xem video].
NGUYÊN TẮC HOẠT ĐỘNG CỦA PCR
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ [Hình 1]:
- 1 - Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 oC, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiến DNA bị biến tính trở thành dạng mạch đơn.
- 2 - Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 oC, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu.
- 3 - Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ được đưa lên 72 oC, Taq polymerase sẽ sử dụng dNTP để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
Như vậy, cứ qua một chu kỳ nhiệt, số mạch DNA sẽ được nhân đôi. Nếu chu kỳ nhiệt lặp lại liên tục 30 - 40 lần thì số bản sao sẽ là 230 ~ 240 bản sao. Số lượng bản sao DNA khổng lồ này khi được gắn các phân tử phát tín hiệu [ví dụ Ethidium Bromide] có thể nhìn thấy bằng mắt thường trên gel điện di dưới ánh đèn UV [Hình 2].
trên gel agarose nhuộm bằng Ethidium Bromide
VẤN ĐỀ NGOẠI NHIỄM SẢN PHẨM PCR
Nguyên lý của PCR là khuếch đại DNA, vì vậy các phòng thí nghiệm sử dụng PCR liên tục không sớm thì muộn cũng sẽ bị nhiễm sản phẩm PCR lên tất cả các thiết bị, dụng cụ, hóa chất. Người làm thí nghiệm sẽ nhận ra được thảm họa này khi toàn bộ các lần chạy PCR đều ra dương tính, kể cả khi sử dụng mẫu là nước cất. Khi điều này xảy ra thì chỉ có cách bỏ toàn bộ hóa chất, khử nhiễm toàn bộ phòng thí nghiệm .... Dù vậy điều này vẫn sẽ tái diễn sau một khoảng thời gian sử dụng PCR.
Nhiễm sản phẩm PCR từng là thách thức đối với các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Tuy nhiên, hiện nay các nhà khoa học đã có thể giải quyết vấn đề này một cách khá hữu hiệu [Hình 3], đó là trong thành phần dNTP có bổ sung thêm một ít dUTP. Các sản phẩm PCR tạo ra sẽ luôn tồn tại một số vị trí là U thay vì T, các vị trí U này sẽ có thể xử lý phân hủy bằng enzme UNG. Mẫu DNA thu nhận từ mẫu thật [template] sẽ không chứa U, vì vậy ủ PCR mix với enzyme UNG trước khi PCR sẽ giúp phân cắt toàn bộ các DNA ngoại nhiễm mà không ảnh hưởng đến template.
CÁC KỸ THUẬT PCR THƯỜNG GẶP TRONG XÉT NGHIỆM
1] PCR đơn mồi [Simplex PCR]: Đây là kiểu PCR cổ điển nhất, sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại 1 đoạn trình tự mục tiêu duy nhất.
2] PCR đa mồi [Multiplex PCR]: Đây là kiểu PCR sử dụng nhiều cặp mồi khác nhau để khuếch đại các trình tự mục tiêu khác nhau trong cùng 1 mix phản ứng. Để thiết kế được phản ứng Multiplex PCR đòi hỏi các cặp mồi sử dụng phải có cùng nhiệt độ bắt cặp và các cặp mồi này cũng không được bắt cặp với nhau hay bắt cặp chéo lẫn nhau. Ngoài ra, cũng phải đảm bảo độ nhạy Multiplex PCR tương đương với Simplex PCR, điều này rất khó xảy ra nên thông thường multiplex PCR được sử dụng ở các tế bào nuôi cấy vì lúc này số lượng trình tự đích đủ lớn sẽ không đòi hỏi quá khắt khe về độ nhạy.
3] PCR tổ [Nested PCR]: Sử dụng 2 cặp mồi, cặp mồi bên ngoài [outer primer] và cặp mồi bên trong [nested primer]. Cặp mồi bên ngoài sẽ tham gia PCR lần 1 trước để làm tăng số lượng DNA chứa trình tự đích, kế đến là cặp mồi bên trong sẽ tham gia PCR lần 2 để phát hiện trình tự đích [Hình 4]. Kỹ thuật này sử dụng khi cặp mồi đặc hiệu cho trình tự đích [nested primer] có độ nhạy kém.
4] RT-PCR: Là quy trình sử dụng khi trình tự đích là RNA, lúc này cần một bước sử dụng enzyme reverse transcriptase để chuyển RNA thành cDNA trước khi PCR, giai đoạn này gọi là giai đoạn RT. Kỹ thuật RT-PCR có 2 loại [Hình 5]:
- - RT-PCR 2 bước: Bước ủ RT thực hiện ở 1 ống nghiệm riêng, cDNA tạo thành sẽ được chuyển vào ống nghiệm chứa PCR mix để thực hiện PCR.
- - RT-PCR 1 bước: Cả 2 bước RT và PCR đều thực hiện trong 1 ống nghiệm duy nhất, mix ban đầu sẽ chứa cả các thành phần cho RT lẫn cho PCR.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phạm Hùng Vân. PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các ứng dụng thường gặp.
Kĩ thuật realtime PCR [định lượng dựa trên tín hiệu huỳnh quang] với độ nhạy và tính đặc hiệu đã trở thành “tiêu chuẩn vàng” để phát hiện/định tính và định lượng DNA. NEB cung cấp một dòng sản phẩm mang thương hiệu LUNA bao gồm các hóa chất đã được tối ưu cho realtime PCR định lượng cả DNA và RNA và dòng sản phẩm này phù hợp cho cả phương pháp sử dụng Dye hoặc Probe đánh dấu huỳnh quang. Tất cả các sản phẩm mang thương hiệu LUNA đều có hiệu năng cao đối với nhiều loại mẫu đầu vào cũng như đích cần xác định khác nhau.
Mỗi bộ LUNA qPCR Master Mix [mix sẵn enzyme Hot start Taq] được tổng hợp đều bao gồm một chất nhuộm Reference Dye phù hợp áp dụng cho nhiều hệ thống máy khác nhau bao gồm cả các hệ thống sử dụng ROX là tín hiệu Reference. Do đó không cần phải bổ sung bất kì hóa chất gì khác để cho phù hợp với hệ thống khách hàng đang sử dụng. Hỗn hợp cũng bao gồm các nucleotid tự do [dUTP], cho phép loại bỏ [tránh tồn dư] khi sản phẩm phản ứng được dùng cho các ứng dụng tiếp theo như xử lý bằng NEB’s Antarctic Thermolabile UDG. Có chất nhuộm màu xanh [blue] có thể nhìn thấy bằng mắt thường giúp dễ theo dõi chất lỏng khi thao tác bằng pipet và các ống qPCR.
Enzyme phiên mã ngược được sử dụng trong bộ kit RT-qPCR là một enzyme thế hệ mới, được thiết kế với công nghệ WarmStart để tăng hiệu suất và hiệu quả hoạt động cũng như độ bền nhiệt của enzyme.
Với những đặc tính đó, kết hợp với độ nhạy, nhanh, chính xác của các hệ thống realtime PCR, các sản phẩm LUNA là một lựa chọn toàn diện phù hợp cho tất cả các thí nghiệm qPCR hay RT-qPCR:
- Một sản phẩm cho nhiều ứng dụng, dễ lựa chọn
- Master mix pha sẵn tiện lợi và dễ sử dụng, protocol quy trình đơn giản cho thiết kế phản ứng.
- Có màu nhìn thấy để dễ quan sát và kiểm soát thao tác
Các sản phẩm của dòng Luna – Lighting the way:
Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline – Mỹ tại Visitech: Đơn vị tư nhân chế tạo thiết bị thí nghiệm, hóa chất sinh vật học phân tử, dụng cụ đo kiểm, sản phẩm test nhanh… cam kết chất lượng, chất lượng tối ưu cùng giá cả đặc trưng hợp lý. Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline có chứa các thành phần quan yếu để tạo nên hệ đệm ưa thích cho phản ứng PCR như dNTP, MgCl2 và Taq polymerase. Mặc tuy thế, dung dịch này không có sẵn khuôn mẫu ADN và mồi nên Có thể được phục vụ tất cả những vận dụng không giống nhau tại phổ biến phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline: TSKT & biểu lộ sp tham số kỹ thuật:
- Tên sản phẩm: Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline
- Hãng sản xuất: Bioline
- Xuất xứ: Mỹ
- Quy cách đóng gói:
- Code BIO-25041:
- Cho 200 phản ứng
- Hộp/ 4 ống, mỗi ống một.25ml
- Code BIO-25042:
- Cho 1000 phản ứng
- Hộp/ 20 ống, mỗi ống một.25ml
- Code BIO-25041:
- Nồng độ: 2X
miêu tả sản phẩm:
Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline được khuyến nghị cho tất cả những ứng dụng PCR tiêu chí. Sản phẩm là 1 sự hài hòa độc đáo của MyTaq DNA polymerase và một hệ thống đệm mới mang lại sự khuếch đại PCR sản lượng vô cùng cao trên một loạt những mẫu PCR. tuy nhiên, Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline chỉ yêu cầu thêm nước, mồi và mẫu buộc phải Có thể giảm 1 số bước trong quá trình cài đặt PCR, giúp tiết kiệm thời kì, giá thành, đổi mới tốc độ và tính năng tái tạo xét nghiệm.
đặc thù, sản phẩm còn cho giấy phép phản ứng PCR nhanh hơn so với những polymerase khác, qua ấy, giảm thời gian chạy tổng thể, cho Kết cục nhanh hơn nhưng vẫn bảo đảm được tính đặc hiệu.
Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X Bioline-Đặc điểm-Ứng dụng điểm đặc biệt nổi bật:
- giản đơn, dễ sử dụng, rất thuận tiện
- Giảm sự nhiễm chéo, tiết kiệm thời gian
- ưng ý với rộng rãi khoảng trống phản ứng khác nhau
- khả năng khuếch đại đáng tin tưởng và mạnh mẽ
- đảm bảo công hiệu khuếch đại PCR maximum
- vận dụng linh hoạt với rộng rãi loại mẫu khác nhau
- 1 mastermix toàn bộ trong một ống mang đến sự thuận lợi và độ chuẩn xác cao của những thiết lập PCR
- An toàn, nhanh chóng
Ứng dụng:
- Nhân bản TA
- PCR chuẩn
- PCR nhanh
- PCR sản lượng cao
- PCR khuẩn lạc
bên cạnh Dung dịch Master Mix PCR – MyTaq Mix 2X, Visitech còn sản xuất một số sản phẩm khác như Kit identifier Staphylococcus trong thực phẩm – Staph ID – Microgen, Dung dịch đệm TBE 10X Tris-Borate-EDTA, Chất nhuộm DNA chuyển đổi cho Ethidium Bromide – 6X GelRed Loading Buffer with TriColor, Máy ly tâm máu, Nồi hấp vô trùng, Súng đo nhiệt độ bằng hồng ngoại… áp dụng trong 3 lĩnh vực VI SINH – HÓA SINH – Y SINH!
Link: //visitech.vn/dung-dich-master-mix-pcr-mytaq-mix-2x/